重组Ta1长效融合蛋白的制备及其活性初步研究文献综述

 2023-02-10 10:02

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

课题背景：

胸腺肽(Thymosin)是一类胸腺上皮细胞产生的对淋巴细胞的分化、成熟和免疫活性具有重要作用的多肽激素的总称，又称胸腺激素或胸腺素。胸腺肽alpha;1为胸腺肽alpha;家族中的一员。近年来由于其具有较高的生物学活性和稳定性等而受到极大关注。胸腺肽alpha;1由28个氨基酸组成，分子量3108.37，PI为4.2。它是一种针对T细胞的免疫增强剂［1]。分子中不含半胱氨酸，因此无二硫键。胸腺肽alpha;1无糖基化，唯一的修饰是N-端的乙酰化，但乙酰基的存在与否对Talpha;1生物活性并无显著影响［2]。体外生物活性测定表明，Talpha;1的活性为TF5(胸腺五肽）的10-1000倍，且更耐酸、耐碱、耐热[34]。Talpha;1 可用于癌症患者手术或放化疗后的康复、乙肝的治疗、脓毒血症的治疗、丙肝的辅助治疗等等。起初多采用化学合成法合成Talpha;1，但由于此法产率较低，成本较高，使其临床应用受到了限制。为了满足日益增长的临床需求，降低患者的费用，近来利用基因工程的方法生产Talpha;1。此法具有高效、快速、低成本等优点，是一种非常有吸引力的大批量生产的方法［5]。

尽管Talpha;1临床用途广泛，但是100min的体内半衰期相对较短，不能充分发挥疗效。为了延长Talpha;1在人体内的半衰期以更好地发挥临床效果，我们采取构建并表达Talpha;1和IgG抗体Fc片段的融合蛋白。

Fc融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物学活性的功能蛋白分子与Fc片段融合而产生的新型蛋白［6]。Fc 融合蛋白的重要特点是包含Fc 片段，同时，这也是影响其理化性质和生物学活性的关键因素。抗体类药物往往具有较长的血浆半衰期，人体内源性免疫球蛋白在FcRn 的保护下，血浆半衰期能达到19d。Fc 融合蛋白含有的Fc 片段也能够通过类似的原理延长其半衰期，即Fc 片段通过CH2-CH3 与FcRn 结合并呈pH 依赖性[7]：在pH 7.4 的生理条件下，FcRn 与Fc 不结合；在细胞内涵体pH 6.0~6.5 的酸性条件下，两者结合，从而避免融合分子在细胞内被溶酶体等快速降解。同时，融合Fc 片段能够增大分子体积，降低肾清除率[8]。除了长效性，Fc 片段还能提高分子的稳定性。Fc融合蛋白可以通过Fc 铰链区的二硫键连接形成稳定的二聚体，进一步通过对二硫键的基因工程改造和修饰，还可以使Fc 融合蛋白聚集成六聚体复合物[9]。Fc 区域可以独立折叠，保证伴侣分子体内外的稳定性。

本实验将融合基因插入原核表达载体并将重组载体转入大肠杆菌。通过不同种类的诱导剂：IPTG（异丙基-beta;-D硫代半乳糖苷）或乳糖以及不同诱导剂的浓度分别诱导表达目的蛋白，经SDS-PAGE确定蛋白表达量，从而优化目的蛋白表达条件。然后，在最佳条件下大批量诱导表达蛋白，通过镍柱分离纯化，脱盐后冻干收集目的蛋白。

对8周龄ICR雄性小鼠构建免疫缺陷模型,造模成功后给予融合蛋白制成的悬液。一段时间后观察小鼠胸腺和脾脏生长情况，测量小鼠体内细胞因子IFN-gamma;和IL-2的含量变化。

实验设计方案：

1、Talpha;1-Fc融合蛋白的表达

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