一、课题解决的问题及文献综述
随着社会的发展，肿瘤疾病频发，尤其恶性肿瘤因其治愈率低，死亡率居高不下备受人们关注，肿瘤已经严重威胁到了人们的健康。抗肿瘤药物中靶向抗肿瘤药物的治疗针对性强，是一种在细胞水平上针对已经明确的致癌位点进行治疗的药物，通过设计给药方式可实现精准靶向。靶向抗肿瘤药物进入体内后特异性地选择致癌位点结合并发挥作用，致使肿瘤细胞特异性死亡。
目前认为肿瘤的发生和发展过程大致可分为激发、促进、恶化、进展和转移5个阶段。新近研究证实超过50%的MicroRNAs(miRNAs)基因定位于肿瘤相关基因区域或脆性位点，表明miRNAs与人类肿瘤的发病机理密切相关。
MicroRNAs是目前研究最为广泛的一类内源性非编码小分子RNA, 长度范围在16~29个核苷酸,平均长度约22个核苷酸,进化上高度保守。转录后水平上调控真核生物超过三分之一的基因表达。MiRNA编码基因大多存在于基因间隔区、内含子及转录子内部,且多数miRNA属于内含子miRNA(intronic-miRNA) [1]。研究证实在许多肿瘤病例中都发现miRNAs表达异常的现象，即miRNAs可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。有关研究表明，对于过表达原癌基因的miRNAs，可通过引入与其互补合成的抗miRNA寡聚核苷酸，有效地灭活肿瘤细胞中的这类miRNAs。相反，过表达具有肿瘤抑制基因作用的miRNAs，利用病毒或脂质体的表达系统瞬时引入大量抑制肿瘤基因miRNAs，是一种较为理想的治疗手段[2]。进一步研究显示，在肝脏组织中miR-122是其特异的miRNA, miR-122缺失与原发性肝细胞癌(HCC)预后不良、转移有关。miR-122在正常肝脏中表达较丰富,而在肝细胞癌中,表达明显降低,这表明miRNA可能对维持肝脏功能起着重要作用。
此外，以miRNA作为新的切入点，也可以为肿瘤多药耐药的研究开辟一条新途径。通过对药物敏感性及非敏感性细胞在miRNA表达谱上区别的分析,找到影响药物作用的关键miRNA，这不仅有利于肿瘤细胞耐药机理的深入分析,更有利于寻找新的药物作用靶标及个性化用药[3]。miRNAs药物基因组学的最终目标是通过分析病人的miRNA及miRNA特征谱,结合其他分子标志,预测病人对某种药物的反应程度,从而因人而异地给予最有效的化学治疗。
索拉菲尼(Sorafenib)是一种Raf激酶和吡啶类酪氨酸激酶抑制剂，为新型的口服靶向药物，体外试验显示它有抑制肿瘤细胞增殖和抗血管生成作用。索拉菲尼抑制肿瘤细胞的靶部位CRAF、BRAF、V600EBRAF、c-Kit、FLT-3和肿瘤血管靶部位的CRAF、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-beta;。Raf激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶，而c-Kit、FLT-3、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-beta;为络氨酸激酶，这些激酶作用于肿瘤细胞信号通路、血管生成和凋亡阶段。体内试验显示，在多种人肿瘤抑制裸鼠模型中，如人肝细胞肿瘤、肾细胞肿瘤中，索拉菲尼可抑制肿瘤的生长和血管生成。近年来索拉菲尼被广泛应用于临床肝癌的治疗中，是唯一能够口服的治疗晚期肝癌的分子靶向药物。但是在索拉菲尼的临床应用过程中也发现了不同程度的不良反应，如皮肤反应、恶心、腹泻、体质量减轻、高血压等，影响了患者的长期使用依从性，进而影响治疗效果。同时目前仍有研究探讨细胞的自噬作用与索拉菲尼化疗效果降低之间的关系[4]。综上所述，目前仍需构建得到具有优良生物相容性和高靶向性的载药系统，以达到精准靶向的目的，减轻药物的不良反应，充分发挥药效。
高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）是一类组成、密度、颗粒大小极不均一的脂蛋白。其主要由一个磷脂单分子层（包括未酯化的胆固醇、磷脂和载脂蛋白）和疏水性内核构成。高密度脂蛋白作为药物载体具有多种优点[5]：①HDL作为内源性物质，可完全被生物降解，无毒无害；②能逃避人体免疫系统的识别，避免被网状内皮细胞消除，获得相对较长的半衰期；③颗粒体积小易从血管内扩散到血管外；④通过受体介导被细胞吸收和内吞，具有一定的主动靶向性；⑤较大脂质核心的容积可作为贮存疏水性药物的空间；⑥具有多种载药方式，可以装载大量不同性质的药物。但是天然HDL的获得需要从血液中提取，大规模的制备具有一定的难度，生物安全性问题及提取的代价过高也限制了天然HDL作为药物载体的发展潜力。
重组高密度脂蛋白（recombine high density lipoprotein, rHDL）是由内源性分离或体外合成的载脂蛋白A1与磷脂酰胆碱在体外重组形成，在生化特性和功能上与内源性新生HDL类似。重组HDL主要由apoA-Ⅰ与磷脂酰胆碱组成，缺乏天然HDL所含有的apoA-Ⅱ、apoE、对氧磷酶-1（paraoxonase-1，PON1）等多种蛋白质和酶类，但是保留了天然HDL在胆固醇逆转运、抗炎、抗氧化及抗动脉粥样硬化等方面的功能。高密度脂蛋白的重组工艺一般采用胆酸盐透析法、干片法、去脂重组法。目前，rHDL纳米粒的制备方法多限于薄膜分散法，但此法有一定的局限性，一些水溶性药物不容易被运载，有实验表明[6]，对于水溶性药物盐酸多柔比星而言，硫酸铵梯度法制备的rHDL纳米粒在包封率方面优于薄膜分散法，因此针对不同种类的药物，采取最合适的方法制备rHDL纳米粒对拓宽其应用范围有重要意义。
本课题旨在通过对重组高密度脂蛋白不同制备方式的研究，选出针对于化疗药物索菲尼拉的最适宜制备方法，并结合对miRNA基因药物的研究，以粒径和包封率为指标，探究构建RGD-rHDL/So/Dm纳米粒及性质评价的方法。
二、主要研究内容和方法
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