小鼠海马神经干细胞体内分析系统的优化文献综述

 2023-01-28 11:01

神经干细胞（neural stem cells ，NSCs）是一类具有自我更生及广泛分化潜能的细胞, 处于分化的非终末状态, 可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化成逐渐变小的子细胞, 最终产生中枢神经系统的3种主要细胞,即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，长期以来认为神经干细胞主要分布于大脑的室下区（SVZ）和海马的齿状回(DG)。正常情况下中枢神经系统内 NSCs的数目较少，并且神经再生的发生频率很低，在损伤或疾病状态下，神经干细胞能够促进神经元的再生和脑组织的修复。而海马主要与学习和记忆功能有关，提高海马内神经干细胞的自我更新及分化能力可能有助于改善阿尔兹海默症等神经系统疾病。因此小鼠海马神经干细胞的体内分析系统的建立将用于检测小鼠在不同年龄、不同病理状态及给予不同药物后海马内神经干细胞数目、增殖、分化情况的变化情况，为神经系统疾病如阿尔兹海默症等神经系统疾病的治疗提供依据。

海马齿状回(DG)的颗粒下层区域（SGZ）作为神经发生的位置，会产生新的神经元进入粒细胞层（GCL）并逐渐形成成熟的神经元。DG区的神经干/祖细胞可以根据其形态、标志蛋白质的表达、分裂方式和增殖能等分成两种：一种放射状胶质样细胞具有三角形胞体，细胞核位于SGZ区，突起位于GCL区，并表达nestin,Sox2，胶质纤维酸性蛋白（ glial fibrillary acid protein，GFAP),vimentin和 brain lipid-binding protein (BLBP),称为静息态神经干细胞（quiescent neural progenitors，QNPs)，另一种称为激活态神经干细胞（amplifying neural progenitors，ANPs)，没有放射性突起，表达BLBP，Sox2 和nestin，但不表达 GFAP, vimentin, 和 NeuN。QNPs可不对称分裂产生QNPs和ANPs或产生星形胶质细胞（astrocyte），但分裂频率较低，ANPs可对称分裂，产生的子细胞可进一步分化为成神经细胞（neuroblast）、未成熟神经元（immature neuron）和粒细胞（grannule cell）等。另外，核苷类似物5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU)可在细胞分裂S期掺入DNA，作为细胞增殖的marker。

我们利用QNPs和ANPs表达蛋白的种类和细胞形态的差异，利用免疫组化染色区分QNPs和ANPs:认为Sox2阳性，GFAP阳性、位于SGZ区、并有伸向GCL的树状突起的细胞为QNPs，而Sox2阳性而GFAP阴性、位于SGZ区的没有树状突起的为ANPs,可用DAPI和Sox2进行细胞核共定位，GFAP进行细胞质定位。小鼠心脏灌流后取脑，进行冰冻切片，根据均匀系统随机抽样原则选取一系列脑片，用不同来源的多克隆抗体分别与GFAP,Sox2和Brdu结合，再用连有荧光基团的相应的二抗及DAPI与之结合，用不波段的光激发产生不同荧光，并利用双光子共聚焦显微镜（confocal）成像，察并拍摄标记的细胞，利用无偏体视学（unbiased stereology）方法定量研究海马结构内SGZ区神经干细胞数目和种类。

本课题需要解决的关键问题有:(1).需优化四种marker（GFAP,Sox2，Brdu和DAPI）进行免疫组化共染的条件（包括封闭条件、抗体浓度、抗原修复方法、DNA暴露条件等）;(2).运用体视学（stereology）方法对细胞进行分类统计，建立重现性好，信噪比低的染色结果，细胞能清晰区分并准确计数的系统。

进度安排如下：

2月25日-3月1日：查阅文献，确定方法，制定实验计划

3月2日-3月17日：免疫组化染色（Sox2，GFAP,DAPI共染），摸索Sox2，GFAP一抗浓度；确定抗原修复条件；学习使用confocal对组织细胞观察和计数。

3月18日-3月31日：不同年龄小鼠海马QNPs和QNPs计数；学习小鼠灌流取脑，冰冻切片方法；

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