新型Nrf2-Keap1蛋白-蛋白相互作用小分子抑制剂的设计、合成及生物学评价文献综述

 2022-12-24 05:12
  1. 背景以及文献综述

人体常常会受到内源性和外源性亲电物质的侵袭，这会使细胞产生活性氧如超氧根（O2-·）和活性氮如过氧亚硝酸根（ONO2-）。持续的高水平的活性氧和活性氮会使细胞处于氧化应激状态。持续的氧化应激，会损伤细胞核酸、蛋白质以及脂质膜，导致慢性炎症，引起诸多与炎症相关疾病的发生，如癌症、心血管疾病、神经系统疾病[1-3]。为了抵御这样的损伤，细胞进化出了精密的抗氧化系统和细胞保护机制，能够广泛上调细胞保护因子水平，维持机体稳态[4-5]。其中，转录因子Nrf2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）是调控抗氧化系统和细胞保护机制的关键。碱性亮氨酸拉链结构转录因子Nrf2，通过与这些抗氧化保护基因启动子上共有的抗氧化反应元件ARE（antioxidant response element, 5rsquo;-GTGACnnnGC-3rsquo;）结合，继而介导超过100个抗氧化基因的转录和抗氧化蛋白的表达，这其中包括I相和II相解毒酶、转运蛋白、伴侣分子等[6-8]。Nrf2在细胞中主要受Keap1（Kelch-like ECH-associated protein-1）的调控。生理稳态下，Keap1介导Nrf2的泛素化，使Nrf2在蛋白酶体中降解。应激状态下，Keap1失活，Nrf2与Keap1解离，Nrf2进入到细胞核中，与ARE结合，上调细胞保护因子的表达，最终保护细胞。因此，Keap1-Nrf2-ARE信号通路是细胞抗氧化，维持细胞稳态的关键通路。目前，已有大量靶向Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控剂被报道，其中绝大多数为Nrf2激活剂，它们常用于治疗氧化应激及炎性相关疾病。此外，近年来也有许多关于Nrf2抑制剂的研究，他们利用Nrf2抑制剂破坏恶性肿瘤中的氧化还原平衡，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[9-10]。

Nrf2是一个66 kDa，隶属于CNC（Cap-N-Collar）转录因子家族的转录因子 [11]。人类的Nrf2由605个氨基酸组成，可以分6个高度保守的结构域Neh1-Neh6[12]。其中Neh1, Neh3, Neh6靠近Nrf2的C端，Neh2, Neh4, Neh5靠近Nrf2的N端。Neh1结构域具有亮氨酸拉链bZIP结构，该结构主要负责与小Maf家族蛋白形成异源二聚体，而后与DNA结合，完成 Nrf2的细胞核定位，激活基因的转录[13-14]。高度保守的Neh2结构域，对Nrf2起负调控作用，其主要通过DLG和ETGE序列与两分子的Keap1 Kelch区域形成Keap1-Nrf2复合物[15-16]。Neh2结构域中的7个赖氨酸残基是Nrf2在蛋白酶体降解的关键 [17]。Neh2中的丝氨酸是Nrf2与Keap1解离的关键，丝氨酸的磷酸化，会导致Nrf2从Keap1上解离 [18]。Neh3结构域包含CNC bZIP结构，是Nrf2介导ARE基因转录的必要结构。Neh4和Neh5结构域属于转录结构域，其能够与cAMP应答元件蛋白（CBP）的KIX和CH3区域结合，与CBP共同启动基因的转录[19-20]。Neh6结构域具有丰富的高度保守的丝氨酸序列，对Nrf2具有异于Keap1的负调控作用。

图1-1 Nrf2结构示意图

Nrf2靶向调控众多基因，这些基因涉及谷胱甘肽的合成，活性氧（ROS）的消除，异源物质以及药物代谢等方面，近年来染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation ChIP）技术的出现，让我们对Nrf2的靶基因信息有了更深入的了解[21-23]。根据这些信息，我们可以将Nrf2的靶基因分为5类：（1）谷胱甘肽合成和连接酶；（2）抗氧化酶/蛋白；（3）异源物质代谢和转运酶；（4）代谢相关基因；（5）转录因子。Nrf2通过诱导表达这些靶基因和蛋白，帮助细胞代谢排泄异源物质，抵抗氧化应激产生的活性氧，维持内环境的稳态，从而保护细胞，免受炎症的损伤。Nrf2的细胞保护作用，已经在Nrf2敲除小鼠实验中得到证明，Nrf2敲除型小鼠较正常鼠更容易患有肿瘤、炎症等疾病[24-26]。

Keap1是一个分子量为69.7 kDa的肌动蛋白结合蛋白，对Nrf2起到负调控作用，它由625个氨基酸组成，其中有27为半胱氨酸，在这些半胱氨酸中， Cys151, Cys257, Cys273, Cys288, Cys297, Cys434, Cys613对于活性氧和亲电物质具有高度敏感性[27]。Keap1主要包含5个结构域：（1） N端结构域（NTR）；（2） BTB结构域（Broad complex, Tramtrack, and Bric-a-Brac）；（3） IVR结构域（the linker intervening region）；（4） Kelch 结构域；（5） C端结构域（图1-2）。其中BTB区域负责Keap1的同源二聚化，同时也负责与Cul3-E3泛素连接酶形成复合物[27-28]。富含半胱氨酸IVR结构域，是细胞内氧、核输出信号的感受区域，它是Keap1发挥功能的重要部位。六叶beta;-螺旋构象的Kelch区域由6个重复的Kelch（KR1-KR6）序列组成，是Nrf2结合区域（与Nrf2结构中的Neh2区域结合） [29-31]。

图1-2 Keap1结构示意图

在Keap1-Nrf2-ARE信号通路中，Keap1是调控蛋白，它通过感受细胞的氧化应激状态来控制Nrf2的水平。在正常的生理状态下，Nrf2与Keap1结合，Keap1作为接头蛋白，与Cul3-E3泛素连接酶形成复合物，介导Nrf2在蛋白酶体中降解，整个过程半衰期t1/2少于20分钟，因此不会使Nrf2的靶基因过度表达[32-35]。其具体过程是：Keap1通过BTB区形成同源二聚体，二聚体Keap1分别与Nrf2的Neh2区域结合，继而使Nrf2在26s蛋白酶体中降解。Nrf2泛素化过程发生在一段由7个赖氨酸残基构成的alpha;-螺旋上[36]。在应激状态下， Keap1-Nrf2-Cul3复合物构象发生改变，Nrf2不能被泛素化，Nrf2稳定性得到提高。目前针对Nrf2的稳定性有两种模型来解释：一种是门栓-铰链模型（hinge and latch model），另一种是Keap1-Cul3解离模型（Keap1-Cul3 dissociation model）[35,37]。

在Keap1-Cul3解离模型中，处于氧化应激状态下的细胞，其Keap1 BTB结构域的半胱氨酸残基，尤其是Cys151，被共价修饰，最终导致Keap1与Cul3解离，Nrf2的泛素化被阻断，Nrf2稳定性提高[36]。

在门栓-铰链模型中，Keap1的同源二聚体分别与Nrf2的Neh2上的ETGE和DLG序列相连，这两个序列对Keap1的亲和力有较大区别，其中ETGE与Keap1亲和力强，形成“铰链”，固定Nrf2与Keap1，DLG与Keap1的亲和力较弱，形成“门栓”结构，根据细胞氧化应激状态进行Nrf2与Keap1的结合和解离[18,34]。在氧化应激状态下，Keap1上的半胱氨酸残基被共价修饰，导致“门栓”被打开，Nrf2的泛素化被阻断，Nrf2在细胞中蓄积并进入到细胞核，与小Maf蛋白形成异源二聚体，继而与ARE结合，最终调控靶基因的转录[38]。Toshihiko Ogura等人利用单粒子电子显微镜从结构上证实了门栓-铰链模型的合理性，因此该模型也是目前最被广泛接受[39]。

图1-3 Nrf2的稳定机制

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