PEG修饰G-CSF产物的分离纯化及活性检测文献综述

 2023-01-31 10:01

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、课题的研究背景、意义和目的

粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)是一种多肽链的造血生长因子,由单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生,能与细胞表面的特定受体结合,调节粒细胞的增殖与分化,促使中性粒细胞系造血祖细胞生长和分化,保护中性粒细胞避免凋亡并加强它们的功能。临床上主要应用于肿瘤化疗引起的中性粒细胞减少症，用于外周干细胞动员，与抗生素合用预防或治疗感染等。由于人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）天然来源非常有限，产量甚微，远不能满足临床应用的需要，大量生产有赖于基因工程技术。然而相对于化学药物而言，G-CSF作为蛋白质类药物，其稳定性差，在体内易受到酶的降解以及肾脏的滤过作用而导致其体内循环半衰期短，生物利用度低，往往需要频繁注射来维持疗效；而长期注射又有可能会引发抗体产生而降低疗效。为了延长蛋白质类药物的体内半衰期,现在有许多技术手段对药物进行改造,其中蛋白质的化学修饰被广泛运用。

在蛋白质的化学修饰中，修饰剂的选择极为重要。修饰剂选择得当，既可以保留蛋白质生物学活性，又能延长其在体内的停留时间，降低其免疫原性。聚乙二醇（PEG）因其良好的生物相容性、无毒性和无抗原性等优点而为人们所广泛使用。

PEG为一种亲水、不带电荷的线性大分子，当它与蛋白质的非必需基团共价结合时，可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，避免免疫反应的产生，或者阻止抗原与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。蛋白质经PEG修饰后，相对分子量增加，肾小球的滤过减少；PEG的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白酶水解，同时减少了抗体的产生，这些均有助于蛋白质类药物循环半衰期的延长，从而达到提高药效，减少用药次数的目的。PEG-rhG-CSF与rhG-CSF作用机制相同，都是与细胞表面特异性受体结合，促进骨髓造血干细胞的分化和增殖，但PEG化后的rhG-CSF的血清半衰期明显得到延长（从3.5小时延长至大约15-18小时）。

聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子（PEG-rhG-CSF）是通过将PEG醛共价偶联到rhG-CSF的N-末端氨基上而形成的长效制剂。该药物最早由安进公司开发,商品名为Neulasta,于2002年获得美国FDA批准上市。Neulasta大大提高了rhG-CSF的体内半衰期，每个疗程仅需给药一次，大大提高了用药便利性，市场反映也较好。在世界范围内，Neulasta在2009和2010年的销售额分别为33.5亿美元和35.6亿美元。鉴于该药广阔的市场前景，Teva和诺华公司先后推出了仿制药并已在欧洲获得批准销售。近年来我国抗肿瘤药物市场以17％的速度增长，与此同时，我国癌症发病率呈上升趋势。过去分泌型重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）一直依赖进口的被动局面，由于价格昂贵,在国内也一直没有得到有效的推广。rhG-CSF是被医药界公认的目前基因工程药物中最具有使用价值的三个药品之一。因此，研制该仿制药具有极大的经济利益和广阔的市场前景。

本实验室前期构建、表达、并纯化得到了G-CSF,本课题并对PEG修饰G-CSF的反应条件以及修饰产物纯化方法进行研究，以期获得单个聚乙二醇修饰的重组人集落刺激因子(PEG-G-CSF)，并对修饰前后G-CSF的体内外生物学活性进行考察，为研制和开发PEG-G-CSF提供理论基础和实验依据。

二、课题研究的主要内容

1. G-CSF的PEG修饰

1.1 探索优化pH、温度、复性时间、蛋白与PEG的化学配比等。

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