药物诱导表皮干细胞重编程研究文献综述

 2022-12-24 05:12
  1. 研究背景：

1.重编程技术及其分类

许多疾病的产生都是由于人体细胞的死亡或者功能的缺失，为了使具有特定功能的细胞再生，研究者们做了许多的实践。其中，随着对胚胎干细胞的研究与时俱进，人们开始尝试通过不同的方法使已经分化的细胞去分化，重新获得如同胚胎干细胞一般，在体外具备无限增殖、自我更新及分化成3个胚层所有细胞的潜能[1]，我们将这种技术称为重编程技术。

当前，实现细胞的重编程技术主要有三种途径：体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)、诱导多能干细胞技术(induced pluripotent stem cells, iPSCs)和细胞融合技术(cell fusion)[2]。SCNT技术最广为人知，即克隆技术，通过将供体细胞的细胞核提取出来，移植至去核的卵细胞中，使已经分化的细胞再次获得全能性。虽然从John Gurdon得到克隆爪蛙开始[3-4]，Wilmut[5]、孙强、刘真等人[6]都相继推动了SCNT技术的发展，但重编程效率低下、成功率低以及培养出的克隆体往往伴随着免疫缺陷、寿命短的特点，再加上关于克隆的伦理问题一直难以解决，这一方法并没有得到实质性的进步与发展。而细胞融合技术则是通过将两种不同物种的细胞进行融合，得到一种名为异核体的多核细胞，而两种细胞之间则存在支配与被支配的关系。利用这一点，人们通过将体细胞与具有全能性（如EC、ES、EG等细胞）的细胞融合，使得体细胞也获得全能性，实现细胞的重编程。[7-10]但是，细胞融合也存在以下缺点，由于融合的细胞具有多基因组，无法用于基因治疗；成功率低，且由于细胞间有选择性，在细胞筛选上需要花费很大的时间与经历，故实现重编程效率低下[11]

2.诱导重编程机制以及发展

本文将把诱导多能干细胞技术作为研究的重点。由于通过诱导获得的多能干细胞具有与胚胎干细胞相近的全能性，并且来源为患者自体细胞，同时又不需要经历胚胎状态就可以使其重编程，避免了伦理问题和排斥反应[1、12]。更为重要的是，诱导多能干细胞技术培养出的iPCs虽然处于实验阶段，但是其进一步应用于临床治疗的前景非常可观。根据转录因子对细胞特性的影响，Davis等人利用生肌决定因子（Myod）将体细胞有到位肌细胞[11、13]，这对诱导多能干细胞来讲有着重要的启发作用。2006年，Takahashi和Yamanaka利用OSKM因子（即Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4），将其导入体细胞后成功诱导出于胚胎干细胞有着相同全能性的iPS细胞[14-15]，其中Oct3/4不仅可以抑制细胞某些分化基因的表达，同时可以激活多能性基因的相关序列；Sox2作为哺乳动物胚胎发育期间的重要调控因子，微弱的变化就会触发ES细胞分化为多种细胞类型，它同Oct3/4互相协同，一同影响着重编程进程；c-Myc虽然并不是诱导技术中所必须的，但是在诱导的早期，其可以提高细胞的存活率，并促进细胞的增殖，与其他三种因子进行协同作用[16-17]。但是，c-Myc的激活往往带来肿瘤的产生，为了降低这种风险，人们开始使用同家族的L-Myc和N-Myc进行替换。[18]

虽然研究取得了进展，但是重编程技术在诱导方法、载体选择以及重编程效率、安全问题上都有一些问题，随着相关技术团队的持续研究和关注，越来越多的新方法推动着诱导重编程技术的进步。Anokye-Danso利用miR-302/367激活了纤维细胞的Oct3/4、Sox2，成功诱导了iPs的产生,并提高了重编程的效率。[19]由于外源重编程因子容易整合在细胞基因组中,并且多种重编程因子参与了癌症相关信号通路的调控, 因此最大限度地减少诱导体系转录因子的

数量是提高iPS细胞生物安全性的第一步。使用小 分子化合物代替重编程因子是提高iPS细胞安全性、优化iPS细胞技术的研究方向之一。Huangfu D等人利用HDACi和VPA能够有效地替代c-Myc完成了小鼠成纤维细胞的重编程。[20]邓宏魁教授团队通过对CiPS细胞化学诱导过程的进一步研究使用视黄酸配体激动剂AM580和H3K79 甲基转移酶Doltl1抑制剂EPZ004777或SGC0946显著增加XEN样细胞的产生，从而提高CiPS细胞的诱导效率, 缩短诱导周期。[21]裴端卿教授课题也对化学诱导体系做出了优化, 他们采用化学成分确定的无血清诱导培养基iCD1, 在VC6FZ之外还添加了之前报道过的可以显著促进iPS细胞诱导的化学小分子维生素C、Bmp4、BrdU、AM580和可以促进MET过程的Doltl1抑制剂EPZ5676及SGC0946缩短了CiPS的诱导周期并获得较高质量的iPS细胞。[22]香港大学刘澎涛教授课题组筛选到的小分子化合物组合也可以将小鼠胚胎干细胞、iPS细胞或单个八细胞期胚胎卵裂球诱导为具有嵌合到胚胎和胚外能力的EPS细胞。他们的诱导体系包括白血病抑制因子LIF和六种信号通路小分子抑制剂: MEK抑制剂PD0325901、GSK3-beta;抑制剂CHIR99021、JNK抑制剂VIII、p38抑制剂SB203580、Src激酶抑制剂 A-419259和Tnks1/2抑制剂XAV939。这些都表明使用不同化学小分子组合诱导重编程获得类全能性 EPS细胞具有着不同的潜在机制，我们可以不断地对诱导重编程技术进行优化。

  1. 研究目的：

利用细胞培养技术，鉴别、分离、培养相关的表皮细胞，利用诱导重编程技术，通过观察药物对体细胞重编程为多能干细胞的效率和效果，对候选药物进行筛选，从而得到重编程效率较高的药物及方案。

  1. 研究内容：

1、建立分离皮肤细胞、皮肤干细胞方法；

2、建立皮肤干细胞鉴定方法；

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