PTX NRs-siRNA复合物的构建与表征文献综述

 2022-12-26 05:12

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

  1. 课题背景

近年来，恶性肿瘤已然成为威胁人类健康生活的最大杀手之一，在不断探索更加安全有效治疗手段的过程中，化学药物治疗仍是抗肿瘤最常用的方法。紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，具有天然的抗肿瘤活性，在临床上已广泛用于治疗乳腺癌、卵巢癌和子宫癌等发病率较高的癌症。紫杉醇的抗癌机制主要是干扰微管蛋白解聚使肿瘤细胞凋亡，由于该药物在治疗过程中不具备肿瘤靶向性，仅有很少部分达到肿瘤部位发挥作用，对机体产生明显的毒副作用。欲使紫杉醇在癌症治疗领域发挥更重要的作用，就要设法降低其毒性以保障患者用药安全有效，基于此治疗目标的靶向肿瘤纳米载药体系应运而生。目前已研发出数种新型的靶向制剂，而紫杉醇杆状纳米晶（PTX NRs）凭借它极高的载药量、有效的递送效率以及简单的制备工艺等特点脱颖而出，成为研究人员瞩目的焦点，极具应用前景。

RNA干扰（RNAensp;interference，RNAi）是真核细胞内由非编码小RNA特异性识别目的基因并抑制其表达的生物学现象，也被称作基因沉默（gene silencing）。这是一种在进化上高度保守的基因调节机制，通过调节基因的表达，沉默入侵生物体的外源性致病基因来保护自身基因组的正常功能。小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）是一种由20~25个核苷酸构成的非编码双链RNA，它通过形成RNA引导的沉默复合物（RNA induced silencing complex,RISC）引起目的基因的降解。siRNA的基因沉默现象被揭示后，相关人员围绕它进行了大量研究，发现siRNA仅引起基因一过性的表型丧失，并不导致基因自身的变化，具有可逆、高效、特异、便捷等特点，这些优点为其在疾病的基因治疗领域争得一席之地。siRNA作为分子药物用于治疗人类疾病的研究数年前便已开始，理论上机体内所有的基因都可以被合理设计的siRNA所沉默，这反映出siRNA极大的应用价值。涉及siRNA的临床技术正在迅速发展，我们要在适度开发其疾病治疗潜能的同时，对其应用过程中需遵循的伦理原则进行合理的风险-获益评估，只有这样才能为人类带来福祉。

  1. 问题和解决方案

紫杉醇是一种分子量小、水溶性差、对肿瘤组织不具备靶向效应的化学治疗药物，而且它在到达靶部位之前易被代谢，仅有很少量的药物能达到病灶发挥疗效，如何在递送抗癌药物的同时消除其疗效限制因素成为当下研究的出发点。以物理手段将紫杉醇制成纳米颗粒，能明显增加其水溶性，使药物能够更加容易进入体内，且该纳米粒子能够利用肿瘤组织的PH环境有效渗入细胞并在肿瘤部位大量积累，减少其对正常组织的伤害。

siRNA分子量大、负电荷性高、膜穿透能力弱、稳定性差、生物分布不当等特点限制了其细胞摄取和递送，且siRNA可能与非靶基因结合出现脱靶效应导致一系列不可预测的副作用，因此选择适当的载体是siRNA在靶部位实现基因沉默的关键所在。早期采用阳离子载体尤其是PEI、PAMAM、阳离子脂质体等，通过静电作用与siRNA的负电荷基团结合，克服siRNA递送的障碍，提高siRNA的转染效率。然而这些阳离子载体的正电荷性来源于其分子结构中的高密度胺，即使在剂量极低的条件下，也会产生很强的毒性，而且这些常规阳离子载体在体内的血液循环时间短，限制了它们进一步的临床应用。此外，载体-基因复合物倾向于积聚在溶酶体内，siRNA在溶酶体的酸性PH、大量水解酶的环境中易被降解，故而需要开发出能有效递送siRNA且具有良好生物相容性的新型载体以实现siRNA在肿瘤部位的高效递送。

研究表明，紫杉醇杆状纳米结晶能以小窝蛋白途径绕开溶酶体入胞，若以该纳米粒子为载体，将siRNA与之复合，形成抗癌药物和大分子的共递送系统，一方面能实现siRNA高效的递送，另一方面也能提高PTX NRs的细胞敏感性与抗肿瘤作用，实现基因治疗和化学治疗的协同作用。现通过仪器分析，优化原料配比，选制出具有最佳粒径、粒子形状、压缩比、Zeta电位等特性的复合物，同时，设计一系列体内外试验，检测siRNA是否成功复合到纳米颗粒上并产生预期疗效。

  1. 可行性分析

本课题研究理论假设合理，目标内容清晰，实施的可操作性强；其次，课题组成员在近几年为该课题研究做了大量的准备工作，收获了许多与该课题有关的研究成果，指导该课题的老师在该领域颇有建树，科研资金充足，能够承担课题研究任务；此外，本实验室科研氛围浓厚，各成员相处融洽，相关科研仪器设施完备，对课题完成有充分保障。

  1. 研究方法和内容
  2. PTX NRs的制备：采用抗溶剂沉淀法，将10mlCLG溶液（1mg/ml）与1ml丙酮（含20 mg PTX)混合均匀并不断搅拌，先用超声探针处理样品，再减压蒸发除去残余的丙酮溶剂，整个制备过程的温度控制在4℃以下。
  3. PTX NRs的表征：利用荧光检测和圆二色谱证实CLG对PTX NRs中药物微粒的稳定作用；根据动态光散射原理，采用90Plus Particle Size Analyzer测定纳米粒子的粒径、PDI、Zeta电势等。
  4. PTX NRs-siRNA复合物的制备：在PTX NRs制备完成的基础上加入等量的siRNA溶液并混合，室温下培养30min，使此二者者在静电引力的作用下形成稳定的复合物；在此基础上，可以继续加入HA进一步形成复合物。
  5. PTX NRs-siRNA复合物的表征：根据动态光散射原理，采用90Plus Particle Size Analyzer测定复合物的粒径、PDI、Zeta电势等；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析不同配比CLG/siRNA构成的复合物并将其优化；采用透射电子显微镜检测纳米粒子的形态大小等。
  6. 稳定性与释放实验考察：a.采用琼脂糖凝胶电泳法评估复合物的稳定性：以不同的CLG/siRNA配比制备PTX NRs-siRNA复合物，将复合物与含GelRed的缓冲液混合培育30min，在混合物中加入10%甘油和2%SDS，然后将其电泳30min，最后用Bio-Rad高灵敏度化学发光成像系统拍摄获取结果；b.采用透析法考察药物释放：以恒温箱为实验环境，不同PH值(PH7.4，6.8，5.0)的PBS作为释放介质，根据预定的时间间隔，将样品从透析袋中取出，并用等体积的相应新鲜PBS替换，样品经0.2mu;m膜滤器过滤后，用高效液相色谱（HPLC）检测其PTX含量。
  7. 细胞摄取与细胞毒考察：将MCF-7和Caco-2细胞接种在12孔平板上，在37℃条件下培养48h，用细胞摄取抑制剂进行前处理后，将纳米颗粒导入细胞，在无血清培养基中37℃下培养48h，然后用PBS清洗三次，最后用胰蛋白酶处理再收集，分别用FCM和CLSM测定其荧光；采用MTT法和LDH法评估细胞活力，将4T1, A549，Caco-2细胞接种在96孔平板上培养48h,移去培养基换上200micro;L RPMI(含需考察的药物) 继续培养48h，然后在每个孔中加入20micro;L MTT(5 mg/mL)再培养4h，移去培养基后在每个孔中加入 200 micro;L DMSO，最后在波长570nm处测定样品的吸光度。
  8. 工作计划

2月25日-3月12日：熟悉实验室环境，学习相关仪器的基本操作，完成文献查阅、开题报告等前期工作。

3月13日-5月中旬：逐步进行课题研究，获得相关实验数据，为毕业论文撰写提供依据。

5月中旬-五月底：完成毕业论文的定稿。

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