开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一种双功能融合蛋白的分离纯化及抗肿瘤作用研究
一、研究背景
肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，某一细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。肿瘤生长可以分为无血管期和血管期。无血管期的肿瘤细胞主要靠周围组织的弥散提供营养及排泄废物，细胞的增殖和凋亡处于动态平衡之中，肿瘤直径不超过2~3mm ,一般不发生转移。进入血管期后，肿瘤内开始出现新生血管，由血液提供营养并带走代谢产物，此时，细胞凋亡明显减少，肿瘤迅速生长并发生转移。血管新生在肿瘤生长及转移过程中起到关键作用，因此血管生成抑制剂也成为治疗肿瘤的一个重要方向。肿瘤血管的生成取决于血管生成促进因子和抑制因子之间的平衡状态，当二者间的平衡状态被打破,血管生成促进因子表达高于血管生成抑制因子时,肿瘤血管便开始形成。在众多血管生成促进因子当中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor , VEGF)被认为是专一的作用最强的一种因子，是诱导血管生成的主要调节因素,它可以促使血管内皮细胞有丝分裂并最终形成新生血管，因此VEGF也成为抗肿瘤血管形成治疗过程最为理想的靶目标之一。
人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin , hCG) 正常时由胎盘滋养层细胞产生，只会在女性妊娠期大量表达，然而许多实验发现hCG，尤其是去除alpha;亚基后的beta;亚基，常常异常高表达于多种不同的肿瘤中，如肺癌，胃癌，结肠癌，前列腺癌，乳腺癌等。正常情况下，成人组织细胞的胚胎基因处于静息状态，不表达或表达极其微量的hCG, 当细胞发生恶性转化时，静息的胚胎基因被激活而表达，通过模拟胚胎发育模式促进自身生长，并且对肿瘤生长和逃避免疫系统攻击起重要作用。hCG是肿瘤细胞的特征性标志之一，但不是肿瘤发生的诱因，肿瘤一旦形成就会表达异位hCG(ehCG)。这也为设计一种可诱发抗hCG免疫应答的疫苗治疗hCG依赖性肿瘤提供了依据。
二、拟研究或解决的问题
由于单一靶点的小分子药物治疗范围较窄，且易产生免疫逃逸和耐药性，因此设计构建了含VEGF和beta;hCG两个靶点的抗肿瘤融合蛋白疫苗，以期从抗肿瘤免疫和抗肿瘤血管生成两方面抑制肿瘤的生长。本课题基于实验室已合成的包含VEGF和beta;hCG抗原表位的双功能融合蛋白，探索其分离纯化的条件和方法，并进行动物实验，进一步研究其抗肿瘤作用。
三、研究手段
1.融合蛋白的分离纯化
经大肠杆菌诱导表达后，离心收集菌体沉淀，加入菌体裂解液，于37℃摇床恒温剧烈振荡2h后进行超声裂解，离心后收集上清，弃沉淀。取上清液加硫酸铵粉末至相应饱和度，4℃静置1h后离心,每一级饱和度各取上清和沉淀制备样品，进行SDS-PAGE检测，摸索硫酸铵分级沉淀条件。保留含目的蛋白最多的蛋白沉淀，复溶后于4℃进行透析，12000r/min离心，弃沉淀，上清过阴离子交换柱DEAE-cellulose，用浓度梯度为0-500mmol/L的 NaCl缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰，检测合并目的蛋白峰组分，冻干保存。
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