MDA5抗原的表达纯化以及其四聚体的构建文献综述

 2022-12-27 11:12

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一．研究目的与解决的问题

皮肌炎是一种由淋巴细胞浸润引起的炎症，据推测病因与遗传免疫和病毒感染有关。部分皮肌炎患者血清中存在由人体B淋巴细胞分泌的自身抗体-抗黑色素瘤分化相关抗原5（MDA5）抗体，抗 MDA5自身抗体在中国皮肌炎患者中存在的比例约为36%，抗自身 MDA5抗体阳性患者呈现典型的有病性皮肌炎症状。因此研究患者中的抗MDA5自身抗体分泌的B细胞对进一步了解皮肌炎病因具有重大意义。但是目前还缺乏体外分离MDA5抗体分泌B细胞的有效手段，而文献表明抗原四聚体可增强抗原对特定BCR特异性B细胞的亲和力，亦可增加应用于FCM的荧光标记的染色亮度，可以有效用于B细胞的分离。我们将进行MDA5抗原的表达纯化，并构建其四聚体，将其用于体外分离筛选具有MDA5抗原特异性的B淋巴细胞。

二．研究手段

将MDA5基因进行PCR扩增，将根据MDA5基因的不同结构域（CARD、Helicase Domain、Repression Domain）[1]分别克隆到表达载体pNIC-Bio2，使得表达的MDA5 蛋白的N端含有可以被TEV酶切除的6*His tag，用于亲和纯化，C末端含有可生物素化序列（可生物素化序列可以在体外被BirA生物素化，用于四聚体的构建）[2]。构建好的表达质粒，导入E.coil BL21（DE3）进行扩大培养。然后将扩大培养的E.coil离心沉淀并重新悬浮后，使用超声波细胞破碎仪、Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。

为了实现以上目标，将制备BirA和TEV酶。 TEV由苏州因湃生物提供的pTEV-BL21菌株扩大培养，经超声波细胞破碎仪、Ni-NTA亲和层析[13]和分子筛色谱纯化，并使用Amicon Ultra-15超滤管离心浓缩后得到。BirA酶（生物素连接酶）基因存在于大肠杆菌的基因组DNA中，可识别抗原蛋白质中的一段氨基酸序列，即可生物素化序列（Biotinylation Sequence），然后将与ATP反应的生物素连接与BirA上，再将活化的生物素结合到可生物素化序列的特定赖氨酸上。[11]链霉亲和素是Streptomyces avidinii菌分泌的一种分子量为65KD的蛋白质，由4条相同肽链组成，每条肽链都能结合一个生物素。[5、13]从而通过亲和素-生物素标记法（BAB法）构建四聚体复合物。为了获得BIRA酶，我们将使用菌落PCR扩增出E.coil BirA基因，并与pNIC-MBP质粒连接，经转化、扩大培养后，使用超声波细胞破碎仪、MBP亲和层析提取纯化BirA酶。其中pNIC-MBP质粒中含有MBP基因，MBP可与BirA在翻译时融合表达，有助于BirA基因过表达。[7]

三．成果形式

使用Alexa-488标记检测MDA5抗原四聚体，未来以论文的形式展示。

四．文献综述

1.皮肌炎与抗MDA5抗体

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