草药中吡咯里西啶类生物碱的含量测定文献综述

课题名称

草药中吡咯里西啶类生物碱的含量测定

课题性质

基础研究

毕业设计的选题背景和意义

前段时间，欧盟食品安全局（EFSA）应欧委会的要求，就茶叶、蜂蜜、药草以及食品补充剂中吡咯里西啶类生物碱（PAs）对人体健康的风险发布意见，引起人们关注。

咯里西啶类生物碱（pyrrolizidine alkaloids, PAs）是一类由植物合成的生物碱。迄今为止，已分离发现的600多种PAs及其氮氧化物中，一半以上为有毒生物碱。分布广泛的PAs可以直接通过含PAs的传统草药、茶等或者间接通过食物污染如牛奶、蜂蜜或牧草等对人类或牲畜生命造成极大的毒害[39]。

PAs可引起肝脏、肺脏、肾脏、神经和胚胎毒性，甚至致畸，致突变和致癌[40-42]。人体暴露于PAs，尤其是摄入蜂蜜、茶叶和草药较多的情况，健康可能会受到影响，

目前已引起世界各国食品药品监管及研究机构的高度关注。中国是草药使用大国，但是我国目前尚没有明确的 PAs限量标准及相关法规。因此，开发更加灵敏、特定的实验方法，对常用草药进行PAs的含量测定和分析是非常有必要的。

文献综述

植物中吡咯里西啶类生物碱的检测与分析

吡咯里西啶类生物碱（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是一类天然生物碱，广泛存在于有花植物中。文献报道世界上约6000余种植物中含有PAs，这些植物 95 %以上集中于以下四个科中 ,即菊科(Compositae)、紫草科(Boraginaceae)、豆科(Leguminosae)、兰科(Orchidaceae)。其它少量分布于厚壳科(Ehretiaceae)、玄参科(Scruphulariaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、百合科(Liliaceae)等[1]。

迄今为止，已分离发现的600多种PAs及其氮氧化物中，一半以上为有毒生物碱。分布广泛的PAs可以直接通过含PAs的传统草药、茶等或者间接通过食物污染如牛奶、蜂蜜或牧草等对人类或牲畜生命造成极大的毒害[2]。

PA作用的直接靶器官为肝脏，可引起肝细胞出血坏死 、肝巨红细胞症等，所以又称为肝毒吡咯里西啶生物碱(hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids，HPA ) 。此外，还会引起肺脏、肾脏、神经和胚胎毒性，致畸，致突变和致癌等。[3-4]

大多数PAs是由具有双稠吡咯啶环的氨基醇和有机酸两部分缩合而成，醇部分叫千里光裂碱（necine），酸部分叫千里光裂酸（necic acid）[5-7]。以裂碱的结构来划分， PAs有两种类型，一种是倒千里光裂碱型（retronecine-type），另一种是奥索千里光裂碱型（otonecine-type）。

（图1是双稠吡咯啶环，图2是奥索千里光裂碱型（otonecine-type）的结构，图3是一种PA的结构）

根据蜂蜜和饲料中PA的报告数据和现有文献，欧洲食安局专家组确定了以下对食品和饲料特别重要的PA（包括叔胺以及相应的N-氧化物形式）[8]：

①　Senecionine-type PAs: acetylerucifoline, erucifoline, integerrimine, jacobine, jacoline, jaconine, jacozine, retrorsine, senecionine, seneciphylline. 这些PA多发现Senecionine(菊科),但也存在于猪屎豆属 (豆科)。

②　Lycopsamine-type PAs: acetylechimidine and isomers, echimidine and isomers, echivulgarine, lycopsamine and isomers, vulgarine. 这些PA多发现于紫草科和紫茎泽兰科（菊科）中。

③　Heliotrine-type PAs: europine, heliotrine, lasiocarpine. 这些PA发现于天芥菜属(紫草科)。

④　Monocrotaline-type PAs: fulvine, monocrotaline, retusamine, trichodesmine.这些PA发现于猪屎豆（豆科）中。

PAs 产生毒性的最基本结构特征是 1 , 2 位具有双键，同时 7 位或 9 位的羟基至少有一个被酯化。PAs 结构与毒性关系表现为:二酯毒性大于单酯毒性 ;大环二酯 PAs 毒性大于开链二酯PAs ;retronecine型 PAs 毒性大于otonecine 型；12元环PAs毒性大于11元环PAs ;千里光裂酸部分具有支链的PAs 毒性大于直链PAs。[9]

下面就PA的提取分离及检测分析的技术和手段研究现状进行总结。

1.提取

PAs是一种相对极性有机化合物，因此极易溶于极性有机溶剂。目前常用的提取溶剂为甲醇、乙醇或者稀酸水溶液。提取的方式包括有冷浸、加热提取、索氏提取、超声提取等方式，其中超声是最方便也是最常使用的提取方式[10]。

Tomasz Mrocz等人[11]优化开发出了一种从紫草中提取PA的新型高效方法。该方法基于在1005℃下用热的1％酒石酸甲醇溶液使用电篮提取2小时。该方法检测到总生物碱含量最高，并且最终提取物中共萃取物水平相对较低。

2.分离纯化

PAs的水或醇提取物在痕量分析之前通常需要净化步骤来增加PAs的浓度以及去除干扰化合物。

2.1液液萃取法

液液萃取法是一种传统的生物碱分离的方法，早期的研究者多采用此方法纯化 PAs 。其步骤是:首先将提取液酸化，生物碱以离子的形式存在于水相中，用乙醚、氯仿等有机溶剂萃取，除去叶绿素和其它弱极性物质。再将酸水碱化，使生物碱析出，用氯仿、二氯甲烷等溶剂将其萃取出来，从而达到分离纯化的目的。此方法的缺点是 PAs 及其氮氧化物不能同时被分离纯化，操作过程烦琐，溶剂量耗用较大，且萃取过程中极易出现乳化现象，PAs 损失较多。

2.2固相萃取法

固相萃取法（SPE）是目前较常用的分离纯化方法，几种SPE材料如 Ergosil（一种表面处理过的硅胶）、十八烷基硅烷（C18）和强阳离子交换树脂聚合物（SCX）已成功应用[12]。其中SCX已经成为最常用的材料，尤其是应用在复杂基质（如蜂蜜）的微量元素分析中[13-14]。SCX-SPE 的优点在于在去除杂质大的同时可以将PAs及其氮氧化物以高产率准确洗脱。SCX-SPE的一般程序是首先甲醇过柱活化，然后将提取物施加在SCX-SPE柱上，用水或甲醇冲洗去除干扰化合物，然后在碱性条件下（如含NH3的甲醇）将所有PAs形式洗脱，最后所得洗脱液用氮气吹干再复溶供检测。

3.仪器分析

3.1 TLC

薄层色谱法（TLC）在过去用于分离单独的PAs，并且已经确定了几个常用的固定相和流动相[6]。使用的显色剂通常为生物碱通用显色剂，专属性不强。使用Ehrlich试剂检测不饱和PAs，使用Dragendorff 试剂和亚硝酸盐检测饱和PAs[15-16]。

3.2 NMR

核磁共振分析法（NMR）主要用于PAs的结构鉴定。核磁共振分析可以获得C-13核磁共振谱和1-H核磁共振谱[31]。1-H NMR能够比从C-13 NMR更小的样品中得到更多的结构信息，而且还可以实现1,2-不饱和PAs的定量测定[17]。

3.3 ELISA

用于检测和测量PAs的酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）大多基于针对逆转录因子的抗体[33-34]。它们倾向于与其他PAs混合交叉反应，并且可以提供PAs的大体筛选方法或更具体的靶向方法。竞争性抑制的ELISA用于估算植物和饲料的总PAs含量[18]。

3.4 GC-MS

气相色谱质谱联用技术（GC-MS）可同时用于PAs的结构鉴定与含量检测。由于现代高分辨毛细管气相色谱（HRGC）的高分辨率，PAs的同分异构体可以实现较好分离，并且现有的保留指数数据也有助于识别各个结构的PAs。如Stelljes ME等[19]通过 GC-MS 测定了四种千里光属植物中 PAs,并通过质谱碎片信息，鉴定出24个PAs。但主要的局限性在于PANO不能直接用GC分析，因为它们不能挥发。因此，需要通过适当的预处理步骤将PANO还原为相应的PAs。

3.5 LC-MS

高效液相色谱法（HPLC）分离PAs在目前备受关注，具有同时检测PAs和PANO的优点，从而简化了样品制备步骤以及降低了分析样品变化的风险[20]。但由于PAs的紫外最大吸收较低不在检测器的范围内，因而HPLC不能达到很好的检测灵敏度。高效液相色谱与质谱技术的联用解决了上述问题，其不仅能够分析未知结构的PAs及其衍生物，还具有高灵敏度、检测限低、重复性好、操作方便等优点，因此LC-MS已广泛应用于各类型PAs的定性定量。如濮社班等[21]采用液相色谱与多级质谱联用法从7份款冬药材中检测到5种PA。程莉等[22]采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱MRM模式检测蜂蜜中的PA。

3.6 其他方法

毛细管电泳法（CE）等。

3.7 分析方法总结

由于LC-MS的高选择性和特异性，通过针对性分析，通常只需要极少的样品制备。LC-MS方法提供的检测限低至pg级或更低，主要优点是能够同时分析PAs和PANO并减少样品的前处理步骤，从而大大提高PAs检测的效率。综上所述，目前认为LC-MS是检测PAs的最佳方法。

参考文献

[1]张芳, 王长虹, 王峥涛. 植物中吡咯里西啶生物碱的检测与分析[J]. 天然产物研究与开发, 2006, 18(6):1057-1063.

[2] 王军,王长虹,王峥涛. 吡咯里西啶生物碱的细胞毒性及致毒机制研究进展[J]. 国际药学研究杂志, 2007, 34(4):246-249.

[3]韩佳寅, 梁爱华, 高双荣. 含吡咯里西啶生物碱植物的特殊毒性及致毒机制研究进展[J]. 中国中药杂志, 2011, 36(10):1397-1401.[9]World Health Organization．International programme on chemical safety environmental health criteria 80 pyrrolizidine alkaloids[R]．Geneva，1988.

[4]梁爱华 ，叶祖光 ．千里光属植物的毒性研究进展 [J]．中国中药杂志 ，2006，31(2)：93．

[5] Mattocks AR. Chemistry and Toxicology of Pyrrolizidine Alkaloids. Academic Press, London. 1986,

[6] Hartmann T and Witte L, 1995. Pyrrolizidine alkaloids: Chemical, biological and chemoecological aspects. In: Alkaloids: Chemical and Biological Perspectives, vol. 9. Ed Pelletier SW. Pergamon Press, Oxford, UK, 155233.

[7] Roeder E, 1995. Medicinal plants in Europe containing pyrrolizidine alkaloids. Pharmazie, 50, 83-98.

[8]Chain E P O C I. Scientific Opinion on Pyrrolizidine alkaloids in food and feed[J]. Efsa Journal, 2011, 9(11):n/a-n/a.

[9]Culvenor CCJ.Pyrrolizidine alkaloids:some aspects of the Australian involvement .Trends Pharmacol Sci , 1985 , 6:18-22.

[10] Zhang F, Wang CH Wang, Chen W, Ma LX, Zhang HY, Zhang CF, Bligh M, Wang ZT SWA (2008) Quantitative analysis by HPLCMS2 of the pyrrolizidine alkaloid adonifoline in Senecio scandens. Phytochem Anal 19:2531

[11]Mroczek T, Widelski J, Glowniak K. Optimization of extraction of pyrrolizidine alkaloids from plant material[J]. Chemia Analityczna, 2006, 51(4):567-580.

[12] Crews C, Berthiller F and Krska R, 2010. Update on analytical methods for toxic pyrrolizidine alkaloids. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 396, 327-338.

[13] Betteridge K, Cao Y and Colegate SM, 2005. Improved method for extraction and LC-MS analysis of pyrrolizidine alkaloids and their N-oxides in honey: Application to Echium vulgare honeys. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 53, 18941902.

[14] Zhou Y, Li N, Choi F F-K, Qiao C-F, Song J-Z, Li S-L, Liu X, Cai Z-W, Fu PP, Lin G and Xu H-X, 2010. A new approach for simultaneous screening and quantification of toxic pyrrolizidine alkaloids in some potential pyrrolizidine alkaloid-containing plants by using ultra performance liquid chromatographytandem quadrupole mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 681, 33-40.

[15] Mattocks AR and Pigott DC, 1990. Pyrrolizidine alkaloids from Cynoglossum germanicum. Phytochemistry, 29, 2871-2872.

[16] Hovermale JT and Craig MA, 2002. Metabolism of pyrrolizidine alkaloids by Peptostreptococcus heliotrinreducens and a mixed culture derived from ovine ruminal fluid. Biophysical Chemistry, 101-102, 387-399.

[17] Logie CG, Gruea RM and Liddell RJ, 1994. Proton NMR spectroscopy of pyrrolizidine alkaloids. Phytochemistry, 37, 43-109.

[18] Lee ST, Schoch TK, Stegelmeier BL, Gardner DR, Than KA, Molyneux RJ (2001) Development of enzyme-linked immunosorbent assays for the hepastotoxic alkaloids riddelliine and riddelliine N-oxide. J Agric Food Chem 49:41444151.

[19]Stelljes ME , Kelley RB ,Molyneux RJ, et al .GC-MS determination of pyrrolizidine alkaloids in four Senecio species.J NatProd , 1991, 54:759-773.】

[20] Brown MS, Molyneux RJ and Roitman, JN, 1994. A general method for high performance liquid chromatography of pyrrolizidine alkaloid free bases and N-oxides. Phytochemical Analysis, 5, 251-255.

[21]濮社班, 徐德然, 张勉,等. 中药款冬中肝毒吡咯里西啶生物碱的LC/MS^n检测[J]. Chinese Journal of Natural Medicines中国天然药物, 2004, 2(5):293-297.

[22]程莉, 王丹, 周爽,等. 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定蜂蜜中吡咯里西啶类生物碱[J]. 环境化学, 2014(11):1971-1977.

研究内容

文献报道世界上约有3%的有花植物，即6000余种植物中含有PAs，尤其在菊科、紫草科、豆科这三个科中最为常见。本课题选择豆科作为研究内容进行PAs含量测定。分别在北京同仁堂、西苑医院和安国药材市场三个来源购买测试所需药材。测试药材用硫酸水溶液超声提取2次，合并提取液用C18-SPE纯化富集，甲醇洗脱后氮气吹干复溶后测试，研究方法选择液质联用技术，从而为以后豆科药用植物的使用提供安全保障。

研究手段（计划）

1、样品准备

样品与干冰按1:2混合，然后粉碎至0.25mm或0.5mm。或者采用其它不过热的粉碎方式粉碎至0.25mm或0.5mm。粉碎后的样品用摇床等方式混合均匀。

2、样品提取

取2.0g混合均匀的0.25mm植物粉末到50mL离心管中，

第一次提取：加入20mL提取溶液（0.05 M硫酸水溶液），润湿后，在常温下超声提取15分钟。在3800g下离心102min，上清液转移到样品管中，沉淀继续第二次提取。

第二次提取：加入20mL提取溶液（0.05 M硫酸水溶液），振荡搅散沉淀后，在常温下超声提取15分钟。在3800g下离心102min，上清液转移到第一次的样品管提取液中，混合均匀。

中和：用中和溶液（5ml浓氨水稀释成25ml溶液）中和pH至7.0，约需要0.5-1.0mL中和溶液。中和后的药液过玻璃纤维滤纸，供SPE使用。

3、SPE处理步骤

C18 SPE 在减压真空下操作，首先用5mL甲醇过柱，然后5mL水过柱；取10mL中和后的提取液，上样；然后用5mL水过柱洗涤两次， 真空抽干5-10分钟，用5mL甲醇过柱洗涤两次，所得洗脱液用氮气在50 C 5 C下吹干。

SCX SPE: （样品用未中和提取液）SPE 小柱 (Bond Elut Plexa PCX, 500 mg/6 mL), 首先用5mL甲醇过柱，然后5mL0.05M硫酸甲醇溶液过柱；取25mL提取液，上样；然后用8mL甲醇过柱洗涤， 真空抽干5-10分钟；用5mL 含2.5% NH3的甲醇过柱洗涤两次，所得洗脱液用氮气在50 C 5 C下吹干。

4、样品复溶

3中所得吹干样品加1mL甲醇-水 (5/95, v/v)振荡复溶，取500L在20 000 x g 下离心 10 3 min。上清液供HPLC上样分析。

5、LC-MS检测

5.1 HPLC流动相

A相: 在1000mL容量瓶中，315 mg 甲酸铵溶于约 5 mL水中，加入 1 mL 甲酸，加水至刻度；

B相: 在1000mL容量瓶中，315 mg 甲酸铵溶于约 5 mL水中加入 1 mL 甲酸，加甲醇至刻度。

5.2 标准品溶液

储备溶液（0.1 mg/mL）：用TGA天平精密称取约1 mg标准品，用乙腈溶解并定容在10ml容量瓶中。

标准工作溶液（1 mu;g/mL PA混合溶液）：用Hamilton 微量进样器取各标准品的储备100 mu;L液到10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得1 mu;g/mL PA混合溶液（PA-MIX）。

标准溶液（MMS）：标准溶液采用空白植物基质溶液配制（配制方法暂略）

5.3 LC-MS检测

得出数据，并与参考文献中各PA的保留时间、分子量和碎片分子量等数据进行对比定性、定量和分析。

5.4方法学考察

5.5数据处理及模型建立

应达目的和成果形式

应达目的：得到药典中收录的豆科药用植物中PA的含量及分析

成果形式：一篇论文