PPARgama表达载体的构建及潜在泛素化位点研究文献综述

课题名称

PPARgamma;表达载体的构建及潜在泛素化位点研究

毕业设计的内容和意义

构建稳定的PPARgamma;表达载体，并对PPARgamma;蛋白中的赖氨酸进行定点突变，观察蛋白稳定性变化，来确定PPARgamma;蛋白中泛素化位点及其作用。

文献综述

PPARgamma;功能及泛素修饰研究进展

16400223 张尚然

摘要：过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）是一类重要的核激素受体，其亚型PPARgamma;特异性表达在脂肪组织细胞中，调控着脂质代谢和葡萄糖稳态等重要生理活动。随着研究的深入，PPARgamma;在例如2型糖尿病、炎症等疾病发生发展过程中起到的作用被发现。而PPARgamma;是一种半衰期较短的蛋白质，泛素-蛋白酶体系统是它主要的降解途径。不同E3泛素连接酶催化的泛素修饰也将对PPARgamma;稳定性起到不同的影响。

关键词：PPARgamma;，脂质代谢，泛素修饰

1.背景

过氧化物酶体增殖物激活受体，简称PPAR，是核激素受体超家族中的一个亚家族，广泛表达在心血管系统细胞以及脂肪组织细胞中，参与调控如脂质代谢和葡萄糖稳态等重要生理活动¹。Issemann I 和Green S于1990年克隆出了第一个PPAR基因，并证明过氧化物增殖药物如那菲诺平可以激活该受体，所以将其命名为PPARalpha;²。随着对该基因研究的深入，人们发现了PPAR存在三种亚型，即PPAR-alpha;，PPAR-beta;/delta;和PPARgamma;。

2. PPAR结构及生理功能

三种受体尽管表达范围以及具体调控的生理活动有所不同，但具有相似的分子结构和功能特征。以PPARgamma;为例，其结构可以分为四个结构域。位于N端的A/B结构域和配体无关活性结构1（AF-1）负责PPAR的磷酸化。C结构域为DNA结合区域（DBD）。C端的E/F结构域是配体结合结构域（LBD），配体通过与配体结合结构域来增强靶基因的表达。配体无关活性结构2（AF-2）能实现辅助因子的循环再生³。

图1 PPAR结构域示意图³

配体结合结构域与配体特异性结合之后，将会促进PPARgamma;与另一种核激素受体视黄醇类X受体（RXR）相互作用，形成异二聚体。该异二聚体会与靶基因启动子的过氧化物酶体增殖物反应元件（PPRE）结合，在一些辅因子如共激活物或共抑制物的协助下，完成对靶基因转录的调控。而且PPARgamma;与DNA的结合具备细胞类型特异性⁴。

图2 PPAR调控基因转录机理示意图³

3. PPARgamma;分类

PPARgamma;大量表达在脂肪组织中，并与脂肪合成，脂质存储以及体内葡萄糖稳态有密切联系。在PPAR的三种亚型中，PPARgamma;是研究最充分的一种。根据基因的启动子类型和5rsquo;端情况，PPARgamma;的mRNA可以分为三种，即PPARgamma;1，PPARgamma;2和PPARgamma;3¹。PPARgamma;1和PPARgamma;3翻译出的蛋白质是相同的，统称为PPARgamma;1蛋白。该蛋白在人体所有类型细胞中均有表达。PPARgamma;2蛋白的N端较PPARgamma;1多出了30个氨基酸⁵，主要特异性表达在脂肪组织中。

4. PPARgamma;在疾病中的作用

PPARgamma;在脂肪组织中高度表达，参与脂肪细胞的分化、脂质储存、线粒体偶联蛋白的表达和胰岛素敏感控制等过程。最初，人们认为PPARgamma;的功能是调控体内葡萄糖稳态以及脂质代谢过程。经典PPARgamma;激动剂噁唑烷二酮类化合物就可以调控人体的脂质和葡萄糖的代谢。PPARgamma;激活之后，关于脂质合成的基因被大量表达，前脂肪细胞也由此成熟而分化，最后形成体积较小且对胰岛素较敏感的脂肪细胞。由于脂质的合成，人体内游离脂肪酸（NEFA）浓度也大大下降，通过葡萄糖-脂肪酸循环，增强了人体对葡萄糖的利用⁶。这对于治疗2型糖尿病，减轻代谢综合征有着十分重要的作用。

除了2型糖尿病，PPARgamma;在其他多种疾病的发生发展中都扮演着重要的角色。PPARgamma;激动剂可以作为T淋巴细胞分化的负调控剂，激活炎症反应并参与获得性免疫过程。例如PPARgamma;激动剂吡格列酮就能通过抑制MAPK和NF-kappa;B等信号通路，达到抗炎的作用⁷。PPARgamma;激动剂在皮肤病的治疗中，展现出抑制了内皮细胞增生以及T淋巴细胞介导的炎症反应的良好效果，所以PPARgamma;可以视作具有抗炎活性的免疫调节剂⁸。

5. PPARgamma;蛋白泛素修饰及其作用

PPARgamma;蛋白在细胞内存在时间较短，半衰期约为2小时，其周转率主要受泛素-蛋白酶体系统调控。若使用环己酰亚胺抑制蛋白质合成，PPARgamma;会在短时间内全部降解，而蛋白酶体抑制剂MG132能逆转这个现象⁹。这说明PPARgamma;的降解主要是经由泛素-蛋白酶体途径降解的。同时体外研究表明PPARgamma;的配体结合结构域被泛素修饰，该修饰可在无AF-2结构域协助的情况下完成，这预示着PPARgamma;的泛素修饰可能是其激活转录功能中的一个独立部分⁴。研究表明，人体中不同E3泛素连接酶介导的PPARgamma;泛素修饰对PPARgamma;稳定性有不同的影响¹⁰。如MKRN1催化的K184、K185泛素修饰以及SIAH2催化的泛素修饰能促进PPARgamma;蛋白经由蛋白酶体途径降解，印证了关于PPARgamma;泛素修饰的早期研究^11,12。而像TRIM23和NEDD4则展现出与上面研究不同的效果，其催化的泛素修饰能提高PPARgamma;蛋白的稳定性，抑制其降解从而延长PPARgamma;的作用时间^9,13。这都表明了人体能通过对PPARgamma;蛋白进行不同的泛素修饰，改变其稳定性从而调控脂肪细胞的生理活动，体现了该靶点在如2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等代谢疾病治疗上的重大潜力。但是绝大部分泛素连接酶对PPARgamma;的修饰位置仍是未知的，所以探究PPARgamma;上潜在泛素化位点的研究是十分必要的。

【参考文献】

1 Mirza, A. Z., Althagafi, II amp; Shamshad, H. Role of PPAR receptor in different diseases and their ligands: Physiological importance and clinical implications. Eur J Med Chem 166, 502-513, doi:10.1016/j.ejmech.2019.01.067 (2019).

2 Issemann, I. amp; Green, S. Activation of a member of the steroid hormone receptor superfamily by peroxisome proliferators. Nature 347, 645-650, doi:10.1038/347645a0 (1990).

3 Kota, B. P., Huang, T. H. amp; Roufogalis, B. D. An overview on biological mechanisms of PPARs. Pharmacol Res 51, 85-94, doi:10.1016/j.phrs.2004.07.012 (2005).

4 Floyd, Z. E. amp; Stephens, J. M. Controlling a master switch of adipocyte development and insulin sensitivity: covalent modifications of PPARgamma. Biochim Biophys Acta 1822, 1090-1095, doi:10.1016/j.bbadis.2012.03.014 (2012).

5 Tachibana, K., Yamasaki, D., Ishimoto, K. amp; Doi, T. The Role of PPARs in Cancer. PPAR Res 2008, 102737, doi:10.1155/2008/102737 (2008).

6 Panunti, B. amp; Fonseca, V. Effects of PPAR gamma agonists on cardiovascular function in obese, non-diabetic patients. Vascul Pharmacol 45, 29-35, doi:10.1016/j.vph.2005.11.013 (2006).

7 Zhu, W. et al. PPAR-gamma; agonist pioglitazone regulates dendritic cells immunogenicity mediated by DC-SIGN via the MAPK and NF-kappa;B pathways. Int Immunopharmacol 41, 24-34, doi:10.1016/j.intimp.2016.09.028 (2016).

8 Wang, F., Liu, Y. amp; Bi, Z. Pioglitazone inhibits growth of human retinoblastoma cells via regulation of NF-kappa;B inflammation signals. J Recept Signal Transduct Res 37, 94-99, doi:10.3109/10799893.2016.1171341 (2017).

9 Watanabe, M. et al. The E3 ubiquitin ligase TRIM23 regulates adipocyte differentiation via stabilization of the adipogenic activator PPARgamma;. Elife 4, e05615, doi:10.7554/eLife.05615 (2015).

10 Brunmeir, R. amp; Xu, F. Functional Regulation of PPARs through Post-Translational Modifications. Int J Mol Sci 19, doi:10.3390/ijms19061738 (2018).

11 Kilroy, G. et al. The ubiquitin ligase Siah2 regulates obesity-induced adipose tissue inflammation. Obesity (Silver Spring) 23, 2223-2232, doi:10.1002/oby.21220 (2015).

12 Kim, J. H. et al. Suppression of PPARgamma; through MKRN1-mediated ubiquitination and degradation prevents adipocyte differentiation. Cell Death Differ 21, 594-603, doi:10.1038/cdd.2013.181 (2014).

13 Li, J. J. et al. Ubiquitin Ligase NEDD4 Regulates PPARgamma Stability and Adipocyte Differentiation in 3T3-L1 Cells. Sci Rep 6, 38550, doi:10.1038/srep38550 (2016).

研究内容

本实验首先构建PARgamma;-pCMV重组质粒并使用DH5alpha;细胞对重组质粒扩增，再使用HEK293细胞有效表达PPARgamma;蛋白。使用试剂盒将PPARgamma;蛋白中的赖氨酸逐个突变为精氨酸，再给予环己酰亚胺抑制蛋白质合成，观察PPARgamma;蛋白的存在时间。以此研究PPARgamma;蛋白中的潜在泛素化位点，及位点泛素化的作用。

研究计划

1.构建PPARgamma;表达载体

（1）查询PPARgamma;基因序列，根据其序列特点设计两端引物；

（2）裂解HEK293细胞并提取总RNA，进行逆转录PCR，获得cDNA；

（3）利用设计好的特异性引物进行PCR，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化，获得PPARgamma;基因；

（4）将PPARgamma;基因和pCMV载体进行酶切和纯化后，按照一定比例连接。连接产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化；

（5）制备DH5alpha;感受态细胞，将重组质粒转染到细胞中，培养并筛选，获得单克隆菌株；

（6）裂解单克隆菌株细胞提取质粒并进行测序，确定所需要的PPARgamma;-pCMV重组质粒；

（7）将重组质粒转染到培养的HEK293细胞中，培养并筛选，再通过Western-Blot实验检验重组质粒在HEK293细胞中的表达情况。

1. PPARgamma;基因定点突变及蛋白稳定性检测
2. 根据PPARgamma;基因序列及突变位点，设计不同位点的特异性突变引物；
3. 使用特异性突变引物对PPARgamma;基因进行分段扩增，去除甲基化的模板质粒并将扩增产物环化，将突变后的质粒进行转化、涂板和筛选，得到单位点突变的PPARgamma;-pCMV重组质粒；
4. 将突变的PPARgamma;-pCMV重组质粒转染到细胞中，培养一段时间后向培养基中加入环己酰亚胺抑制蛋白质合成，通过Western-Blot实验检测不同时间细胞中PPARgamma;蛋白含量；
5. 若发现PPARgamma;蛋白突变后含量发生变化，则将该突变PPARgamma;-pCMV重组质粒转染到HEK293细胞中，向培养基中加入环己酰亚胺并进行免疫共沉淀实验观察细胞内PPARgamma;蛋白泛素化情况变化。

特色与创新

本实验使用pCMV载体构建重组质粒并使用HEK293细胞表达PPARgamma;蛋白，能构建出优秀的PPARgamma;表达载体。通过将蛋白中的赖氨酸逐个突变为精氨酸，防止该位点发生修饰，再观察PPARgamma;蛋白泛素化情况和存在时间变化，由此推断泛素化位点的作用。这为PPARgamma;泛素修饰方面的研究提供了充分且必要的补充。