两亲性还原敏感羟乙基壳聚糖-辛胺偶联物载药胶束的药效学评价文献综述

1．课题研究的目的和意义

在临床应用中,抗肿瘤药物的憎水性将严重影响疗效并造成一系列的副作用,因此,这些憎水性药物的增溶方法一直是研究的热点,其中,两亲嵌段聚合物载药胶束体系是目前最有效的方法之一。

两亲性的羟乙基壳聚糖-辛胺偶联物材料新颖，并且具有二硫敏感键，制备成为没有毒性且生物相容的胶束载体，具有良好的载药性能，能大大提高脂溶性药物的载药量，同时敏感键胞外稳定，在一般正常组织无断裂，使载药胶束保证大量载药的同时能提供较高的胞外载药稳定性。由于该敏感型胶束在肿瘤细胞内特异性解体，能于大量快速释放药物，以提高抑瘤效果。本课题目的在于评价该载药胶束的药效学，包括细胞评价如细胞吞噬和胞内释放，以及抑瘤效果评价如MTT等，以证明该前药对目标肿瘤细胞的良好抑制效果。

2．课题研究的主要内容

证明该前药对目标肿瘤细胞有良好的抑制效果：

（1）细胞评价：细胞吞噬和胞内释放

（2）抑瘤效果评价：MTT法

3．研究方法及技术途径

（1）细胞评价：细胞吞噬和胞内释放

①小鼠腹腔巨噬细胞的制备和培养:小鼠腹腔内注射不含FBS的RPMI1640培养液约5ml,72h后颈椎脱臼法处死小鼠,75%乙醇消毒后无菌操作收集腹腔液,1500r/min离心10min并弃去上清,RPMI1640完全培养液(含100ml/LFBS)调整细胞密度至2109/L。经锥虫蓝检测细胞存活率合格后接种于96孔细胞培养板中(200mu;l/孔),37℃、5%CO2培养箱培养24h,轻轻吸弃培养液,再用RPMI1640完全培养液洗去未贴壁细胞,继续培养备用。

②巨噬细胞体外吞噬：取96孔培养板制备好的RPMI1640完全培养液培养的巨噬细胞(200mu;l/孔,细胞密度为2109/L),分别向孔内加入不同终质量浓度的偶联物载药胶束100mu;l,两组中以不加载药胶束为对照组,每个载药胶束浓度均设立8个重复孔。37℃、5%CO2培养箱内培养4h后用PBS液洗3次,每孔内加入终浓度为1g/L的中性红生理盐水溶液200mu;l并培养30min,吸弃中性红溶液,PBS液洗3次后加入细胞溶解液(0.01mol/L冰醋酸与无水乙醇等体积的混合液)200mu;l静置过夜,待细胞完全溶解后,在酶标仪上测定波长540nm处吸光度(A)值。以A值表示巨噬细胞吞噬功能的强弱。并以下表记录结果：

（2）抑瘤效果评价：MTT法

③巨噬细胞体外NO的释放：通过测定小鼠巨噬细胞培养液中NO的稳定氧化代谢产物

亚硝酸盐(NO2-)的含量,间接反映NO的释放量。取上述方法处理的各组细胞,在37℃、5%CO2培养箱培养24h,离心收集每孔内的细胞培养液上清液并加入96孔平底酶标板中。严格按照试剂盒说明依次加入试剂,室温避光反应10min,用自动酶标仪检测A540nm值。并以下表记录结果：

(2)抑瘤效果评价：MTT法

①活细胞在代谢过程中,其胞内线粒体的琥珀酸脱氢酶能将可溶性的四唑蓝还原成不

溶性的蓝紫色沉淀物甲臜(formazan),而死细胞和红细胞则没有这种能力,用有机溶

剂如二甲基亚砜(DMSO)溶解甲臜结晶,然后用酶标仪测定甲臜溶液光密度的OD值。

相关研究表明,在细胞数从每孔200～50000范围内,甲臜溶液的OD值与活细胞数有良好的正线性关系。通过对MTT还原结果进行测定来分析细胞增殖以及药物对细胞的抑制程度。其抑制率=(1-药物OD值/对照OD值)100%,一般抑制率ge;30%判定为药敏阳性,反之为阴性。

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②于对数生长期的K562细胞分别稀释成不同浓度,加入到48孔细胞培养板中,每孔100mu;l,然后每孔加入抗癌药物20mu;l,置37℃、5%CO2孵箱中,培养一定时间,加MTT溶液,每孔20mu;l,继续培养一定时间后,离心1000rpm,15min,弃上清,轻轻扣板于滤纸上,吸去多余液体。每孔加入DMSO100mu;l,振荡混匀后,于DNM9606型酶标分析仪,在单波长570nm处测其OD值,根据公式计算其抑制率，得出结果。

4．实施计划

4．实施计划

1、开题报告：（2013-3-1至2013-3-31）

阅读资料，考虑毕业论文选材，分析题目等毕业论文设计工作，作好前期准备，完成《毕业论文开题报告》。

2、中期检查：（2013-3-31至2013-4-14）

实习中期检查，填写实习中期检查表；

3、完成初稿：（2013-5-31之前）

完成毕业论文初稿，上次毕业论文初稿

4、完成毕业论文终稿：（2012-5-31至2012-6-15）

根据指导老师对论文提出的意见对毕业论文进行反复修改、充实和完善，最后形成定稿。

上传毕业论文终稿。

5．主要参考文献

1.　MosmanT.Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:Applicationandcytotxicityassays[J].ImmunolMethods,1983,65:55-63

2.　BellamyWT.Predictionofresponsetodrugtherapyofcancer:areviewofinvitroassays[J].Drugs,1992,44:689-691.

3.丁培杰.双歧杆菌脂磷壁酸对小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬和NO释放的影响.华中科技大学学报（医学版）,2009年12月,第38卷第6期第812-814页.

4.徐静,吴锋等.应用MTT法检测肿瘤化疗药物的敏感性.华夏医学，1期18卷第140-143页.

5.魏文青,赵满仓,刘晶,焦娟,张艳,付瑶等.MTT肿瘤药物敏感试验的方法学研究.　临床肿瘤学杂志2008年10月第13卷第10期，871-874页.

6.焦真,王星,陈志明等.两亲嵌段聚合物载药胶束研究进展.高分子通报，2010年12月，第十二期，78-81页.