三种黄酮化合物对脂肪细胞糖消耗的影响文献综述

 2023-01-28 11:01

糖尿病是一种常见的有遗传倾向的内分泌-代谢病。其病理生理改变是胰岛素分泌绝对或相对不足,引起糖、脂肪、蛋白质和继发的维生素、水、电解质代谢紊乱。表现为血糖、尿糖升高,病人出现多食、多饮、多尿、口干及全身无力等症状，中医称之为消渴。人发病率为1%~5%,它与癌症、心血管疾病同样被视为世界性三大疾病。由于病因未阐明,尚无根治药物。2型糖尿病发病的两大基本环节是胰岛素抵抗(IR)和胰岛素相对分泌不足,其中IR贯穿于2型糖尿病发生、发展的整个过程。　　 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一种重要的蛋白激酶,短期效应能调节能量代谢,如刺激脂肪酸氧化,增加葡萄糖摄取和糖酵解，长期效应能调节基因转录。AMPK被激活后在增加骨骼肌对葡萄糖摄取、增强胰岛素敏感性、增加脂肪酸氧化以及调节基因转录等方面发挥重要作用。由于在调节糖和脂肪酸代谢方面的作用,AMPK可能为治疗肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病提供了新的药理靶点。近年来, 研究表明槲皮素具有降血糖降血脂作用，木樨草素具有降脂减肥作用；此外研究者利用高通量法筛选谷氨酸脱氢酶抑制剂, 发现EGCG 能有效抑制体内谷氨酸脱氢酶介导的基底细胞增生而促进胰岛素分泌 。【研究目的】　　 在研究中药黄酮成分对胰岛素增敏作用的基础上,进一步观察其对胰岛素抵抗模型细胞胰岛素信号AMPK途径的作用及相关细胞因子分泌的影响,探讨槲皮素、木犀草素、EGCG对脂肪细胞糖代谢的影响以及黄酮成分的降血糖机制。【实验方案】　　1.药物及主要试剂 　　槲皮素(Quercetin, Que)；木犀草素(Luteolin, Lut)；表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)；Metformin，Compound-C。胰岛素注射液；DMEM(Dulbeccos mediated Eagles medium)培养基，青霉素；硫酸链霉素；胎牛血清(Fetal Bovine serum Standard Quality, NBS)；脂多糖(LPS，E.coliserotype055:B5, Sigma)；胰蛋白酶；磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，KH溶液自配。　　2.实验细胞株 3T3-L1前脂肪细胞，巨噬细胞　　方法 将实验分为两组，分别为生理组和病理组。生理组：　　细胞培养及诱导分化 将前脂肪细胞（3T3-L1）培养，传代,分化,培养。第二天选生长良好的细胞接种于48孔板，培养一天。实验分组为空白对照组(Blank),槲皮素,木犀草素,EGCG，阳性对照组，Compound-c。在48孔板盖子上标记。　　（2）葡萄糖消耗实验 待细胞融合后，弃高糖DMEM，PBS轻洗两遍，换成KH，饥饿3~4小时。PBS轻洗一遍，加KH，药物及阳性药组分别加入2mu;l药。每孔再分别加入100mu;l的含有糖的KH液。最后糖的终浓度为11mM。37度孵育4h。用葡萄糖试剂盒测定，每孔取3mu;l于96孔板，每孔再加入混合好的R1R2工作液200mu;l，37孵育15min，492nm扫版,检测培养液中的葡萄糖残量,算出各孔细胞的葡萄糖消耗量,处理数据。病理组：细胞培养及诱导分化同生理组。实验分组为实验分组为：空白对照组(Blank)；模型组(Control)；槲皮素、木犀草素、EGCG，阳性对照组。在48孔板盖子上标记。 细胞融合后，弃高糖DMEM，PBS轻洗两遍，换成KH，饥饿3~4小时。PBS轻洗一遍，加KH，药物组和阳性对照组加药后温育0.5h，加巨噬细胞上清液后(生理状态不加巨噬上清)，加糖2mu;l，使糖的终浓度为11mM。37度孵育4h。用葡萄糖试剂盒测定，每孔取3mu;l于96孔板，每孔再加入混合好的R1R2工作液200mu;l，37孵育15min，492nm扫版,检测培养液中的葡萄糖残量,算出各孔细胞的葡萄糖消耗量,处理数据。【文献综述】

　　 槲皮素、木犀草素、EGCG对脂肪细胞糖消耗的影响

【摘要】 目的：探讨槲皮素、木犀草素、EGCG三种黄酮成分对脂肪细胞糖代谢的机制。 方法：检测药物处理24h或48h后3T3-L1脂肪细胞对培养液中的葡萄糖消耗量。预期结果：槲皮素、木犀草素、EGCG三种黄酮成分在适当的浓度均可显著增加正常3T3一L1前脂肪细胞葡萄糖的消耗.结论：槲皮素、木犀草素、EGCG等中药有效成分可在对培养细胞基本无毒的安全浓度范围内,在基础及胰岛素刺激状态下不同程度增加脂肪细胞对胰岛素的敏感性,改善胰岛素抵抗模型脂肪细胞的糖代谢.【关键词】 槲皮素、木犀草素、EGCG，3T3-L1细胞， AMPK途径， 葡萄糖消耗 ,葡萄糖试剂盒【研究目的】 本研究通过观察槲皮素、木犀草素、EGCG对3T3-L1前脂肪细胞糖代谢的影响,在研究中药黄酮成分对胰岛素增敏作用的基础上,进一步观察其对胰岛素抵抗模型细胞胰岛素信号AMPK途径的作用及相关细胞因子分泌的影响,探讨槲皮素、木犀草素、EGCG对脂肪细胞糖代谢的影响以及黄酮成分的降血糖机制。本文旨在总结并讨论AMPK在机体主要糖脂代谢器官中的作用,并重点分析其在治疗胰岛素抵抗和2型糖尿病中的潜在作用。【实验原理】 脂肪细胞分化失常可导致脂肪组织的过多堆积造成肥胖。大量证据表明肥胖与胰岛素抵抗有高度相关性,是引发2型糖尿病、糖耐量异常、高血压、高脂血症及动脉粥样硬化等代谢性疾病的重要因素。　　AMP激活的蛋白激酶(AMPK)是一种广泛参与调节细胞代谢的激酶,被称为能量感受器。一旦胞浆中AMP /ATP比例升高,或其它因素激活AMPK时, AMPK可增强葡萄糖摄取和利用,以及脂肪酸氧化,产生更多能量，同时抑制葡萄糖异生、脂质合成及糖原合成等通路,减少能量消耗,从而使细胞能量代谢保持平衡。　　脂肪组织是机体能量调节器官在2型糖尿病的发病中起重要使作用，3T3-L1来源于小鼠胚胎成纤维细胞,经克隆扩增而成为前脂肪细胞系,在体外研究脂肪细胞的功能中被广泛应用。本研究通过观察槲皮素、木犀草素、EGCG对3T3-L1前脂肪细胞糖代谢的影响,为进一步深入探讨黄酮成分的降血糖机制提供依据。【实验材料】　　1.药物及主要试剂 　　槲皮素(Quercetin, Que)由西安小草植物科技有限责任公司提供(纯度99%)，木犀草素(Luteolin, Lut)和表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)由南京泽朗医药科技有限公司提供(纯度98%)，用DMSO(含量lt;gt;lt;0.1%)溶解、pbs稀释成相应浓度。胰岛素注射液，国药准字：h32020614，江苏万邦生化医药股份有限公司；dmem(dulbeccos mediated='' eagles='' medium)培养基，gibco公司产品，应用液另加0.06g/l青霉素(80万单位)和0.1g/l链霉素(100万单位)及3.7个g/l碳酸氢钠，ph调整至7.2，青霉素，山东鲁抗医药股份有限公司，批号s051213；硫酸链霉素，shanghai='' mdmy='' science='' ='' technologies；胎牛血清(fetal='' bovine='' serum='' standard='' quality,='' nbs)，批号：a10110-0904='' 上海微科生化试剂有限公司；脂多糖(lps，e.coliserotype055:b5,=''gt;　　PBS配制：氯化钠4g，氯化钾0.1g,十二水和磷酸氢二钠1.042g,磷酸二氢钾0.1g,加500ml双蒸水，搅拌至完全溶解，灭菌备用。　　2.实验细胞株　　3T3-L1，前脂肪细胞，中国科学院上海生命科学院细胞库；巨噬细胞上清（自提）。　　巨噬细胞提取：　　 将小鼠处死后浸泡在75%乙醇中2~3分钟，在超净台剪开小鼠腹部皮毛，注射约8毫升PBS，轻揉小鼠腹部1~2分钟，吸取腹腔液加入6孔板中，待巨噬细胞贴壁后，更换无血清培养基，并加PBS 2ug/ml，48小时后，吸取上清，即巨噬细胞上清（CM）。【实验方案】　　(1)生理组　　①在前脂肪细胞传代的第二天，细胞呈单层生长进行分化，加入分化液（IBMX、Dex、insulin终浓度分别为0.5mmol/L、0.25mu;mol/L、5mu;g/ml）。隔天换只加入insulin（终浓度为5mu;g/ml）的分化液，培养一天。第二天选用生长良好的，以3105个细胞 /ml接种于48孔培养板。每孔加入细胞悬液0.2ml。培养一天。 ② 实验分组为空白对照组(Blank)、槲皮素、木犀草素、EGCG：浓度均为10mu;M，阳性对照组：1mM Metformin，25uM Compound-c。在48孔板盖子上标记清楚。　　③待细胞融合后，弃高糖DMEM，PBS轻洗两遍，换成KH，饥饿3~4小时。　　PBS轻洗一遍，加KH， 空白对照组(Blank)加KH100ul,其余槲皮素、木犀草素、EGCG，阳性对照组，Compound-c 组，每组加KH 98ul ；药物及阳性药组分别加入2mu;l药。每孔再分别加入100mu;l的含有糖的KH液。最后糖的终浓度为11mM。 ④37度孵育4h.　　⑤用葡萄糖试剂盒测定，每孔取3mu;l于96孔板，每孔再加入混合好的R1R2工作液200mu;l，加完后轻拍一下96孔板，使液体更好的混匀。　　⑥37孵育15min，492nm扫版。 ⑦实验数据的处理。(2)病理组 ①在前脂肪细胞传代的第二天，细胞呈单层生长进行分化，加入分化液（IBMX、Dex、insulin终浓度分别为0.5mmol/L、0.25mu;mol/L、5mu;g/ml）。隔天换只加入insulin（终浓度为5mu;g/ml）的分化液，培养一天。第二天选用生长良好的，以3105个细胞 /ml接种于48孔培养板。每孔加入细胞悬液0.2ml。培养一天。　　 ②实验分组为实验分组为：空白对照组(Blank)；模型组(Control)；槲皮素、木犀草素、EGCG：浓度均为10mu;M，阳性对照组：1mM Metformin。在48孔板盖子上标记清楚。　　③细胞融合后，弃高糖DMEM，PBS轻洗两遍，换成KH，饥饿3~4小时。　　PBS轻洗一遍，加KH，空白对照组加198ulKH,模型组加98ulKH，其余槲皮素、木犀草素、EGCG、阳性对照组各加96ulKH；药物组和阳性对照组各加药2ul，加药后温育0.5h，加巨噬细胞上清液100ul后(空白组不加巨噬上清)，各组均加糖2mu;l，使糖的终浓度为11mM。　　④37度孵育4h.　　用葡萄糖试剂盒测定，每孔取3mu;l于96孔板，每孔再加入混合好的R1R2工作液200mu;l，加完后轻拍一下96孔板，使液体更好的混匀。　　⑤37孵育15min，492nm扫版。　　⑥实验数据的处理。【数据处理】　　 检测培养液中的葡萄糖残量,算各孔细胞的葡萄糖消耗量。 所有数据均以mean SD表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，分析差异的显著性，并进一步用Students-two tailed-t 检验，比较组间差异。*plt;gt;【预期结果】　　 槲皮素、木犀草素、EGCG均能显著增加脂肪细胞的葡萄糖消耗。槲皮素、木犀草素、EGCG能够激活AMPK通路,从而发挥抗糖尿病的作用。【讨论】　　 胰岛素抵抗被认为是引发2 型糖尿病的始发因素之一，肝脏、脂肪及肌肉组织是发生胰岛素抵抗的主要部位。　　 近年来研究认为,肥胖、糖尿病是一种慢性炎症状态。AMPK的活化可增加脂肪酸氧化并改善葡萄糖的稳态。由于在调节糖和脂肪酸代谢方面的作用,AMPK可能为治疗肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病提供了新的药理靶点。AMPK作为能量感受器，可以调节下丘脑及多种外周组织的代谢状态。激活骨骼肌、肝脏和脂肪组织的AMPK对胰岛素抵抗及2型糖尿病有明显的缓解作用。所以，开发组织特异性和异构体特异性激活AMPK,或以AMPK的下游底物为治疗靶标,对于进一步研究AMPK在防治肥胖及2型糖尿病中的作用具有重要意义。 总之,现有的研究表明AMPK广泛介入了机体主要糖脂代谢组织的代谢调控过程,可能会成为防治胰岛素抵抗及2型糖尿病的一个新靶点。 近年来, 大量研究发现EGCG 具有类胰岛素作用,其强抗氧化活性对2 型糖尿病及其并发症有良好的防治作用。槲皮素为黄酮类物质,药理研究表明槲皮素具有降血糖降血脂、抗自由基作用。本实验进一步观察槲皮素对3T3-L1脂肪细胞糖消耗的影响。研究及实验表明槲皮素可预防大鼠空腹低血糖,对四氧嘧啶糖尿病小鼠有明显降糖作用,而对正常小鼠的血糖无明显影响。研究表明，木樨草素具有降脂减肥作用。EGCG 可在mRNA 水平和有丝分裂水平抑制相关酶的基因表达, 发挥类胰岛素作用, 直接调节血糖。Koyama 等研究发现, EGCG 具有类胰岛素作用。发现EGCG 能有效抑制体内谷氨酸脱氢酶介导的基底细胞增生而促进胰岛素分泌。 【参考文献】：【1】中药活性成分的降血糖作用及其治疗型糖尿病研究进展，吴忠忱，空军医学高等专科学校 ，吉林132013， 中国中药杂志 1998年第23卷第2期【2】AMPK与胰岛素抵抗，马泽军 陈莉明，国际内分泌代谢杂志2006年1月第26卷第1期【3】槲皮素对糖尿病大鼠降糖作用的观察，曾云先，刘尚勤，北海市人民医院内科，广西北海市 536000 ，同济医科大学附属协和医院，华夏医学，1999年2月，第12卷 第1期【4】木樨草素对肥胖模型大鼠减肥降脂作用的研究，任鹏 贺新生 刘超，食品与机械，2009年3月，第25卷第2期【5】表没食子儿茶素没食子酸酯防治2 型糖尿病的分子机制研究进展，祝宇铭，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所, 北京100050，国外医学卫生学分册2009年第36卷第6期【6】几种中药有效成分对脂肪细胞胰岛素增敏作用的研究，何燕铭，复旦大学博士学位论文【7】AMPK在机体糖脂代谢中的作用，杨航 杨吉春 管又飞，北京大学医学部生理学与病理生理学系,北京100191，生理科学进展 2009年第 40卷第 3期【8】黄芪多糖和小檗碱对3T32L1脂肪细胞糖代谢及细胞分化的影响，王树海、王文健、汪雪峰、陈伟华，中国中西医结合杂志2004年10月第24卷第10期【9】小檗碱对脂肪细胞糖代谢的影响，周丽斌,杨颖，上海第二医科大学瑞金医院 上海市内分泌研究所,上海 200025，上海第二医科大学学报，2002年第22卷第5期【10】杜仲对脂肪细胞糖代谢的影响,孙燕荣,董俊兴,第一军医大学药物研究所,510515,广东广州;军事医学科学院放射医学研究所,100859,北京,中医药学刊,2004年8月,第22卷 第8期【11】葛根素对脂肪细胞糖脂代谢作用研究，赵瑛,周游，哈尔滨商业大学博士后工作站,黑龙江哈尔滨15007，哈尔滨商业大学学报(自然科学版)，第22卷第4期，2006年8月 【12】AMPK作为治疗2型糖尿病新靶点的研究进展，葛斌 谢梅林 顾振纶，苏州大学医学部药理学教研室，苏州中药研究所,江苏苏州，中国药理学通报 　Chinese Pharm acological B ulletin　2008May; 24 (5) : 580～3【13】EGCG对实验性糖尿病大鼠肾脏的保护作用，杨晓 李彩蓉 朱忠华 苏华, 卢远航，华中科技大学同济医学院附属协和医院肾内科, 湖北武汉，430022，中国药理学通报 Chinese Pharmacological B ulletin，2006 Jan; 22( 1): 84~ 8【14】五甲基槲皮素对3T3-L1脂肪细胞药理作用的研究和探讨，丁一，华中科技大学硕士学位论文【15】木犀草素对小鼠巨噬细胞免疫功能的影响，闫庆峰，杨达宽，昆明医学院第二附属医院胸心外科,云南昆明 6501，昆明医学院学报 2007,(3):39~42

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