姓名

杨朦朦

学号

0945619

专业

中药学

指导教师

夏玉凤

课题名称

羟基积雪草苷的排泄特征研究

课题性质

radic;基础研究 应用课题 设计型 调研综述 理论研究

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、拟研究或解决的问题

研究内容

建立大鼠关节炎模型，单次灌胃给予羟基积雪草苷100mg/kg，按设定时间点取大鼠血浆，检测大鼠血浆中羟基积雪草苷的含量，计算药动学参数。

拟解决的关键问题

选择合适的内标物和样品预处理方法，优化实验条件，建立灵敏度高的分析方法。

二、拟采取的研究手段

样品预处理拟比较固相萃取法、液液萃取法等常规的方式，从中优选出最佳预处理方法，检测手段拟选择灵敏度较高的LC-ESI-MS法，

三、文献综述

积雪草为伞形科植物积雪草(Centella asiatica L.Urban)的干燥全草或带根全草。性寒,味苦、辛,具有清热利湿、解毒消肿之功效,临床上用于跌打损伤、流行性脑脊髓膜炎、传染性肝炎等。

成分多为三萜类化合物,其中积雪草苷(asiaticoside)及羟基积雪草苷(madecassoside)以其药理活性丰富,临床作用广泛,为积雪草中的主要活性成分。当前,国内外对积雪草及其活性成分进行了广泛的研究。以下就国内外对积雪草活性成分的分析方法及药理作用的研究进行综述。

1．分析研究

1.1质量分析

积雪草苷和羟基积雪草苷等三萜类化合物为积雪草的主要活性成分,测定方法多采用HPLC法。国内外学者对积雪草的质量分析的研究现状如下。

Zhang FL等^[1]运用HPLC-ELSD法,在水(0.01%三氟乙酸,v/v):乙睛(l.0%甲基三丁基乙醚,0.01%三氟乙酸,v/v)(78:22)为流动相,流速1.0mLmin^-1,柱温30 ℃,漂移管温度为40 ℃,氮气压力为3.5bar的色谱条件下,同时检测了积雪草中积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B的含量。Pan J等^[2]采用RP-HPLC二极管阵列检测器法,以添加了-环糊精的甲醇:水(65:35,v/v)为流动相,在pH4下成功分离并测定了羟基积雪草酸和terminolic acid这对同分异构体,并发现其分辨率随加入的-环糊精的量的增多而升高。Rafamantanana M.H.等^[3]采用HPLC-UV法同时测定了积雪草中积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸的含量。

积雪草中除三萜类化合物外,黄酮类化合物也是其主要的活性成分。王荣等^[4]分别以槲皮素和山奈酚为对照,采用紫外分光光度法在320nm处测定积雪草全草中的总黄酮,该方法操作简便,结果准确,灵敏度高,重复性好,为积雪草全草中总黄酮含量测定的一种切实可行的方法。另外,Pamita B.等^[5]运用高效薄层光密度法定量分析了积雪草甲醇提取液中芹黄素和芦丁两种黄酮类成分。

1.2体内分析

皂苷类成分是积雪草的主要活性成分,由于在肠道内难以吸收,生物利用度底,使其在肠道内与肠道菌群作用滞留时间长,在体内以原型物显示药理活性的可能性较小。翁骏^[6]等通过离体、在体实验研究大鼠肠道内菌群对积雪草苷的代谢作用,结果发现积雪草苷可以在肠内被代谢,且呈阶梯式代谢,糖基逐个被水解,直至全部转化为苷元。积雪草苷和其代谢产物进入血液循环,共同发挥药效作用。黄怀鹏^[7]等采用大鼠在体肠灌流试验,利用HPLC法测定积雪草苷的量,分别研究药物浓度和吸收部位对积雪草苷吸收的影响,结果发现一定范围的药物浓度对积雪草苷的Ka和P_app无影响,其吸收机制为被动扩散。Xiao Chun Zheng等^[8]运用柱前衍生化RP-HPLC,UV检测器法,对比格犬血浆中积雪草酸的含量进行了定量分析,其中用对甲苯胺对被测样品进行柱前衍生化,结果准确,可用于积雪草酸的药代动力学研究。

2．药理作用

2.1抗氧化作用

积雪草具有调节过氧化酶活性,预防氧化应激功能。其提取物不仅可以调节大脑中内源性的氧化应激损伤,而且对神经毒诱导的氧化应激也有调节作用。SubhasreeB等^[9]评估了积雪草的抗氧化活性,并推测清除自由基功能是积雪草预防和治疗关节炎、乳腺癌、动脉粥样硬化等疾病的运作模式。

2.2抗炎作用

羟基积雪草苷能减少胶原诱导性关节炎小鼠(CIA)跺关节软组织中高水平的COX-2表达及PGE₂含量,降低血浆中炎症因子TNF-beta;和IL-6的水平,同时增加IL-10的水平,说明羟基积雪草苷可有效的抑制CIA小鼠炎症反应。LiuMei等^[10]在研究羟基积雪草苷对CIA的作用中发现, 羟基积雪草苷可以抑制CIA小鼠滑膜细胞增生,减轻炎性细胞浸润。此外, 羟基积雪草苷可以降低血清中lgG水平,抑制CIA小鼠耳朵迟发性过敏反应和Cll诱导的淋巴细胞增殖反应。结果表明羟基积雪草苷对CIA小鼠有明显的保护作用,其机制可能与调节异常细胞免疫应答有关。羟基积雪草苷为积雪草中含量较高的成分之一,可认为是积雪草治疗风湿性关节炎的主要活性成分。

2.3对神经系统的作用

积雪草提取物可以影响海马区淀粉样蛋白级联,改变淀粉样蛋白在PSAPP小鼠脑内的病理学,调整伴随阿尔兹海默病神经变性改变的氧化应激反应。

Mohanda Ra KG等^[11]用新鲜的积雪草叶汁按4ml/kg的剂量对7天龄大鼠喂养4-6周后,发现海马CA3区顶树突脊和次级树突脊都显著增加。树突棘的增多不仅表示神经元之间联系的范围增大,而且由于树突棘有放大突触后电位、调节突触效能的作用,所以树突棘的增多不仅仅是接触点的增加,而更重要的是还意味着神经元对许多传入信息整合作用更为复杂化了。积雪草提取物可以提高空间学习记忆能力,可能是通过增加海马CA3区神经元树突分支而实现的。

磷脂酶A2(PLA₂)是一系列参与脂代谢的酶,脑内PLA₂活性增强可以使神经元的性质发生改变,如信号传导、神经递质的合成与释放等发生紊乱,从而导致精神分裂、癫痫等疾病。积雪草水提物对非钙依赖型磷脂酶A2(iPLA2)和胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)的有效抑制率分别为97%,77%,可有效的降低脑内PLA2活性,且毒副作用小,是一种很好的PLA2抑制剂,可用于精神分裂症、癫痫、帕金森等疾病的治疗。

2.4对皮肤系统的作用

积雪草能够治疗多种皮肤病,是由于其主要成分通过增进伤口组织胶原的合成及血管生成,促进伤口愈合。积雪草苷和羟基积雪草苷是积雪草的主要活性成分。羟基积雪草苷可以减少炎性细胞的浸润,促进真皮成纤维细胞增生形成上皮。高剂量(12,24mg*kg^-1)的羟基积雪草苷可以降低烧伤皮肤组织中NO和丙二醛(MDA)含量,提高谷胱甘肽(GSH)和羟脯氨酸的水平。同时, 羟基积雪草苷在体内可以促进血管生成,体外研究发现他还可以刺激内皮细胞生长,从而促进伤口愈合。低剂量的积雪草苷(10^-8-10^-12%w/w)可以增加烧伤组织巨噬细胞内MCP-1和IL-l表达,从而刺激血管内皮生长因子(VEGF)生成,加速烧伤皮肤的血管发生,促进伤口愈合。Haftek等研究发现,0.1%的羟基积雪草苷和5%维生素C联合用药可以有效的改善皮肤老化。

Ermertcan等^[12]通过对积雪草提取物和胶原酶对伤口愈合治疗中的免疫组化学和组织病理学的比较研究,发现与胶原酶组比较,积雪草提取物组诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和转化生长因子 (TGE-beta;)的免疫反应性较强,但层粘连蛋白和纤连蛋白的免疫反应性较弱,所以在伤口愈合初期,胶原酶软膏的效果较积雪草提取物的好。

2.5其它作用

积雪草酸对持久性脑缺血症小鼠具有神经保护作用,可以降低血脑屏障通透性,减少线粒体损伤,是治疗脑缺血症的良好候选药物。^[13]

此外,积雪草还具有抗菌、抗溃疡、抗静脉功能不全、抗肾间质纤维化等作用。这些丰富的药理活性使积雪草及其有效单体成分具有广阔的开发应用前景。^[14]

综上，现在对积雪草的药理作用等有了一个较为系统的认识，虽然仍有部分并不明确，但相信随着实验条件、研究方法的改进以及其他领域新技术、新方法的应用，将会对它的了解越来越精确，用途和用法也越来越明朗。

参考文献：

[1] Zhang Fenglun,We Yinjie,et al.Simultaneous quantitation of three major triterpenoid glycosides in Centella asiatica extracts by high performance liquid chromatography with evaporative light scattering deteetion[J].Biomed.Chromatogr,2008,22:119~124.

[2] Pan Jian , Kai Guiqing,et al.Separation and Determination of Madecassie Acid in Extracts of Centella asiatica Using High Performance Liquid Chromatography with -Cyclodextrin as Mobile Phase Additive[J].Chin J Chromatogr,2007,25(3):316~318.

[3] M.H.Rafanlantanana,E.Rozet,G.E.Raoelison et al.An improved HPLC-UV method for the simultaneous quantification of triterpenic glyeosides and aglycones in leaves of Centella asiatica(L.)Urb(APIACEAE)[J].J.Chromatogr.B,2009,03,018.

[4] 王荣,黎云祥,蔡凌云,等.积雪草总黄酮提取工艺和含量测定研究[J].光谱实验室,2009,26(3):544~549

[5] Pamita Bhandari,Neeraj Kumar,Ajai P.Gupta,et al.A rapid RP一HPTLC densitometry method for simultaneous sdetermination of major flavonoids in important medicinal Plants[J].Short Communication,2007,30:2092~2096.

[6] 翁骏,吕秋军,田瑛,等.肠内菌群对积雪草苷的代谢转化研究[J].中草药,2006,37(7):1008~1011.

[7] 黄怀鹏,刘彩霞.积雪草苷大鼠在体肠吸收动力学研究[J].中草药,2008,39(7):1056~1058.

[8] Zheng Xiaochun,Wang Shenghao,e tal.Determination of Asiatic acid in beagle dog plasma afte roral administration of Ceniella asiatica extract by precolumn derivatization RP-HPLC[J].Jounal of Chromatography B,2009,877:477~481.

[9] B.Subhasree,R.Baskaret,R.Laxmi Keerthana,et al.Evaluation of antioxidant potential in selected green leafy vegetables[J].Food Chemistry,2009,01,029.

[10] Liu Mei,Dai Yue,Yao Xiaojuan,et al.Anti-rheumatoid arthritic effect of madecassoside on type II collagen-induced arthritis in mice[J].International Immunopharmaeology,2008,8:1561~1566.

[11] K.G.Mohandas Rao,S.Muddanna Rao,et al.Centella asiatica(L.)Leaf Extract Treatment During the Growth Spurt Period Enhances Hippocampal CA3 Neuronal Dendritic Arborization in Rats[J].eCAM,2006,3(3):349~357.

[12] Ermertcan,Inan,Ozturkcan,et al.Comparison of the effects of collagenase and extract of Centella asiatica in an experimental model of wound healing:An immunohistochemical and histopathological study[J].Wound Repair and Regeneration,2008,16:674~681.

[13] 杨玉琴 . 羟基积雪草苷大鼠吸收和代谢的研究［D］. 兰州: 兰州大学

[14] 谭欣玮,刘颖菊，等.羟基积雪草苷在SD大鼠体内的药代动力学研究. 重庆医科大学

学生签名：杨朦朦 2013 年3 月 21日

指导教师意见：

指导教师签名： 2013 年 3 月 日

所在教研室审查意见：

负责人签名： 年 月 日