PPARdelta表达载体的构建及潜在泛素化位点研究文献综述

课题名称

PPARdelta;表达载体的构建及潜在泛素化位点研究

毕业设计的内容和意义

构建稳定表达的PPARdelta;表达载体，研究各泛素化位点突变对于PPARdelta;稳定性的影响，探究PPARdelta;潜在的泛素化位点以及生效应物学。

文献综述

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种因肥胖流行而发病率增高的肝脏病理疾病。因此，NAFLD对公众健康所构成的威胁越来越大。目前尚无有效的治疗方法来治疗NAFLD及其所带来的肝硬化、肝癌等并发症。过氧化物酶体增殖激活受体(Peroxisome proliferation activated receptor, PPARs)是一种配体激活的核受体，可调节脂质和葡萄糖代谢以及炎症。PPAR可分为三种亚型，分别为PPARalpha;、PPARdelta;以及PPARgamma;。这三种亚型在体内具有着基于组织特异性的表达以及功能^[1]。

PPARs具有典型的核受体结构域，三种PPAR亚型均具有相似的结构和功能特征。目前主要确定了四种功能域，称为A/B、C、D和E/F^[2]。具体来说，N末端区域的A/B结构域含有一个与配体无关的弱反式激活域，称为激活功能域1 (activation function 1， AF1)，负责PPAR的磷酸化。C结构域通过两个锌指结构结合DNA，这是核受体(NR)超家族的标志，该结构域促进PPAR与靶基因启动子区过氧化物酶体增殖反应元件( PPAR response elements，PPREs)的结合。D域是一个铰链区域，E域是配体结合域( ligand binding domain，LBD)， LBD包含一个依赖于配体的反激活功能域，称为AF-2。C末端还负责与维甲类X受体( retinoid X receptor， RXR)的二聚作用，并负责调节辅助因子蛋白的对接^[3]。

在这些亚型中,PPARdelta;参与包括糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化以及癌症在内的各种代谢紊乱过程。PPARdelta;的主要功能包括调节生殖细胞表达,调节中枢神经系统(CNS) 的神经细胞分化和抗炎作用^[4]。此外,有研究显示PPARdelta;似乎还在脂肪细胞分化和脂质代谢中发挥着重要作用^[5]。在肝脏中，PPARdelta;不仅在肝实质细胞中表达，还在Kupffer细胞和肝星状细胞中也存在着表达^[6]。T. Nagasawa等人使用PPARdelta;激动剂GW501516处理MCD饮食所诱导的小鼠NASH模型，发现其可通过影响脂质代谢和抑制炎症的途径来改善肝脏的脂肪变性以及炎症^[7]。而W. Shan等人发现，在使用CCl₄处理的小鼠肝纤维化模型中，PPARdelta;基因的表达得到了上调，而PPARdelta;基因敲除的小鼠在给予CCl4之后，表现出来与对照组相比更加 加重的肝毒性，这意味着诱导PPARdelta;的表达可能是肝脏对于肝毒性物质的一种保护性反应^[8]。这些都提示我们，PPARdelta;可能在肝脏的炎症和纤维化中发挥作用。PPARdelta;的这些特性也暗示着，其可能具有作为治疗NAFLD的潜在的治疗靶点的潜力。

机体对PPARdelta;表达活性具有着多种多样的调控方式,其中包括有蛋白表达水平、配体以及转录辅助因子等不同层次上的调控.近年来众多证据揭示,蛋白翻译后修饰(posttranslational modifications, PTMs)是机体调节PPARdelta;转录活性的另一重要方式.目前,已报道的PPARdelta;翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、SUMO化等,它们能够改变蛋白构象、调控蛋白相互作用、改变受体与配体间的亲和力,从而调控PPARdelta;下游基因的转录^[3]。

泛素是一种8kDa的蛋白质，与蛋白质共价结合，以使其靶向被26S蛋白酶体降解。蛋白质的泛素化作用发生在赖氨酸残基上，需要由泛素激活酶（E1），泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）组成的顺序激活级联的作用^[9]。泛素化和蛋白酶体介导的降解与核受体的转录活性相关，这些相关性是通过对受体进行细胞水平的调节，以及蛋白酶体活性与转录之间的内在相互作用实现的。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome System， UPS）是负责蛋白质降解的主要细胞机制，也是控制关键调节因子（包括核受体和转录因子）水平的主要细胞机制，PPARdelta;的降解便是主要由UPS所调控^[10,11]。然而，关于调节PPAR降解的机制的研究信息很少。PPARdelta;的降解速度非常地快，半衰期很短，有研究指出，PPARdelta;与配体结合能够抑制受体的泛素化，从而阻止其降解^[12]。因此，PPARdelta;激动剂对受体具有双重作用。 配体诱导构象变化，从而允许共激活物结合和启动子反式激活，与此同时避免参与转录激活复合物的受体泛素化降解。有研究指出，配体是通过阻止PPARdelta;的泛素化来阻断PPARdelta;的蛋白酶体降解。

通过阻断PPARdelta;的泛素化位点，可以避免PPARdelta;被26S蛋白酶体降解，从而提高了PPARdelta;蛋白的稳定性。而人体中不同的E3泛素连接酶介导的PPARdelta;泛素修饰对于PPARdelta;的稳定性有着对应不同的影响。因此我们有必要探究不同泛素化位点的泛素化修饰对于PPARdelta;的功能与稳定性有着怎样的影响。而本实验将通过构建PPARdelta;的表达载体，并通过点突变的方式，将PPAR蛋白上所有的赖氨酸逐一突变成精氨酸，防止该位点发生泛素化修饰，以研究各泛素化位点突变对于PPARdelta;蛋白稳定性的影响，并借此来探究PPARdelta;潜在的泛素化靶点及其功能作用。

引用文献：

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研究内容

本课题主要包括以下两部分内容：

1. 重组PPARdelta;表达载体的构建：从HEK293细胞里提RNA逆转得到cDNA，然后用cDNA为模板PCR得到全长PPARdelta;的CDS区，再插入到表达载体pCMV上。然后转化到DH5alpha;里，挑单克隆，扩增测序，拿到与目标一致的质粒。转染到HEK293里检验其是否表达。
2. PPARdelta;点突变质粒的构建及其所表达蛋白质的稳定性检测：把PPARdelta;蛋白上所有的赖氨酸逐一突变，得到几种突变型质粒。再将这些质粒转染到HEK293细胞内，加入CHX（放线菌酮）检测蛋白稳定性是否发生变化。

研究计划

1. 重组PPARdelta;表达载体的构建
2. PPARdelta;基因编码区全长引物的设计。
3. 从HEK293细胞中提取总RNA，逆转录所提取地总RNA，得到cDNA。
4. 以逆转录得到的cDNA为模板使用PCR技术，扩增得到PPARdelta;相应的基因片段。
5. 将所得到的PPARdelta;基因插入表达载体pCMV上。
6. 将表达载体转化入所制备的DH5alpha;感受态细胞中并接种培养。
7. 挑取单克隆菌落，并进行扩增。
8. 裂解所得到的单克隆菌株细胞，提取质粒并进行基因测序，验证其是否为重组质粒。
9. 提取质粒，并转染到HEK293细胞中，通过Western－Blot实验检验其是否表达。
10. PPARdelta;点突变质粒的构建及其所表达蛋白质的稳定性检测
11. 根据PPARdelta;基因序列与所突变的各个位点，设计相应的突变引物。
12. 扩增所得到的重组PPARdelta;表达载体。反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
13. 扩增产物DpnI消化，去除甲基化模板质粒；然后进行重组反应。
14. 反应产物转化、涂板、克隆鉴定。
15. 将突变的质粒转染到HEK293细胞内，并使其表达，通过Western－Blot实验检验其是否表达。
16. 加入CHX（放线菌酮）检测蛋白稳定性是否发生变化。

特色与创新

本实验通过构建稳定表达的PPARdelta;重组质粒并由HEK293细胞来表达PPARdelta;蛋白，再将蛋白中的赖氨酸逐个突变为精氨酸，防止该位点发生泛素化修饰，以研究各泛素化位点突变对于PPARdelta;蛋白稳定性的影响，并借此来探究PPARdelta;潜在的泛素化靶点及其功能作用。为PPARdelta;泛素修饰方面的研究提供了充分且必要的补充。