开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
研究背景及目的：
抗生素是一种抗菌素，专门作用于人类和动物宿主中的细菌或真菌，被广泛应用于畜牧业和人类医疗保健领域。自1928年英国细菌学家弗莱明发现青霉素以来，抗生素的使用量与日俱增。据统计，2015年全球67个主要国家抗生素使用量已达423亿DDDs（defined daily doses，每日约定剂量），且现有政策不变的情况下，预计2030年将增加202%达到1280亿DDDs。然而，大多数抗生素不能通过吸收或者代谢被完全去除，其相当一部分在生物体内参与相关生化活动后自身不发生变化或部分代谢为活性物质，随尿液、粪便等排泄物直接释放到水体环境中。目前世界各地的湖泊、河流、地下水、自来水、甚至瓶装水均能检出（ng/L - mu;g/L），由此可见，抗生素已然成为水体环境中的典型污染物。抗生素在水体环境中低浓度持续存在可诱导抗生素抗性基因和抗生素耐药性细菌产生，进而通过复杂的水平基因转移使可能感染人类的病原体产生耐药性对人类健康产生严重威胁。近年来，抗生素使用引起肠道微生物群落结构改变的现状引起全球高度关注。肠道微生物参与营养、免疫、代谢等重要生命活动，研究表明，抗生素引起的肠道微生物菌群结构改变，导致鱼类肠道消化不良、增加患病风险以及引发炎症反应等。然而很少有研究能够关注肠道微生物菌群的生态平衡被破坏后的恢复情况以及宿主对其他污染物的响应是否会受到影响等问题。
四环素类抗生素是20世纪40年代末发现的广谱抗生素，其结构特征是分子内含有4个碳氢环组成的平面多环结构，主要包括四环素、土霉素和金霉素，具有预防疾病和促进动物生长的作用，是动物医疗中应用最广泛的抗生素家族之一。2018年欧洲用于动物医疗的抗生素中，四环素占比高达32.4%，中国使用四环素总量在2013年超过1200万吨。四环素在环境中的停留时间长、扩散范围广、积累浓度高（ng/L - mu;g/L），其在水体环境中的高检出率和高浓度水平已经引起人们的重视。接收城市生活污水、医院和制药工业等废水的传统污水处理厂、畜牧业以及水产养殖等人类活动均导致大量四环素进入水体环境中。由于四环素能够通过多种途径进入水体环境，导致其传播范围大，传播途径也多种多样，极大的增加了生物体在环境中暴露四环素的风险。鱼类和贝类等水生生物、藻类以及微生物等高度依赖于水体环境生存的生物将直接暴露于残留四环素的自然水体中，还可通过食物链在生物体内积累。对于人类而言，一方面可通过饮食摄入，如食用残留四环素的畜禽及水产品等肉类、蛋和乳制品，另一方面可通过药物治疗口服或者注射四环素。目前针对四环素开展的相关毒理学研究表明，四环素类抗生素能够抑制或诱导水生生物与生理功能、药物代谢和氧化应激相关的生化指标, 如乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、丙二醛、乙氧基试卤灵-O-去乙基酶和beta;-半乳糖苷酶等的活性或含量, 并可能进一步对鱼类产生较严重的基因和免疫毒性。四环素作为一种广谱型抗生素，能够使肠道土著微生物的多样性锐减，从而改变其生态功能，且在停止暴露后的较长时间内，肠道微生物菌群结构和功能的改变不能复原。由于四环素在水体环境中的来源广泛及其所带来的高暴露风险，目前迫切需要探究其对水生生物造成的影响。
实际环境中，抗生素往往与多种污染物同时存在并发生相互作用。如抗生素和重金属两种污染物可以同时存在于水体环境中，两种污染物之间可能产生拮抗、协同或者相加作用。例如，同时暴露重金属铜和四环素有效减轻了单一暴露铜所造成的斑马鱼胚胎死亡率升高、孵化率降低以及发育迟缓等毒性效应，并证明四环素可以和离子态铜通过形成络合物从而降低铜的生物有效浓度，表现出拮抗作用。然而，考虑到现实场景的复杂性，生物体可能不会持续暴露于抗生素等污染物而出现更加复杂的暴露情况。如废水的不定期排放造成水生生物间歇暴露四环素，并可能再暴露其他污染物，从而可能产生与采取单一暴露方式不同的生态毒性效应。例如，斑马鱼经磺胺二甲嘧啶再暴露后，超氧化物歧化酶以及丙二醛含量均比初次暴露时的水平要高。此外，顺序暴露中夹杂着生物体对污染物的清除恢复，单一暴露抗生素后应该考虑生物体在暴露后恢复的情况。有研究表明，污染物被消除后其毒性效应仍会持续一段时间，部分生理生化指标甚至会继续远离正常值。例如，将斑马鱼暴露于142 mu;g/L三环唑后，经过14 d恢复期，斑马鱼的胆固醇和葡萄糖水平恢复正常，但其甘油酸脂和乳酸含量继续升高。目前关注在实际水体环境中，生物体可能遭遇污染物复杂暴露方式下的毒性效应及其机制等的研究仍然很少；实际环境中抗生素和多种污染物可以共存，重金属是其中一类重要污染物，而四环素和砷的相关研究尚未见报道。
砷是一种广泛分布于自然环境中的重金属致癌物，金属开采和冶炼、农药的生产和使用、燃煤、硫酸工业排放以及废物焚化等人类活动均导致大量砷释放进入环境。目前，全球范围内大部分地区均受到砷污染的影响。美国华盛顿州普吉特海湾地区长期受冶炼厂砷污染，沉积物和上覆水中砷含量分别高达208 mg/kg和90 mu;g/L。超过70个国家地下水As含量较高，印度拉普蒂河流域地下含水层的As含量甚至高达239 mu;g/L。我国珠江三角州地下含水层富含溶解态As，浓度高达161 mu;g/L。水体环境中的重金属砷已经造成了全球范围内的污染问题。已有研究表明，尽管生物能够将无机砷转化为砷甜菜碱、砷糖等被认为无毒的有机砷化和物，高浓度的砷仍具有减缓鱼类等水生生物的生长、抑制进食、引起肝脏等组织损伤并减少产卵量的作用。近年来，由于砷化合物在水体环境和食物（如大米、鱼和海鲜）中广泛存在，其对肠道微生物菌群的影响受到了高度关注。小鼠持续饮水砷暴露（10 ppm）4周后，其肠道微生物菌群组成及新陈代谢水平受到显著影响，如厚壁菌门数量显著减少，吲哚代谢物和胆汁酸含量等发生变化。然而，有关肠道微生物菌群对宿主响应污染物的影响，特别是针对水生生物的毒性研究仍然很少。
斑马鱼作为毒理学、药理学及发育生物学等研究的经典模式生物，具有体积小、发育快、实验周期短及全面的基因序列数据等优势，并且鉴于斑马鱼有87%的基因和人类相似而常常被选为研究对象来反映人类的疾病和健康效应。目前所有的文献报道都说明了应用斑马鱼及其胚胎作为模式生物可以准确地研究污染物的生态毒性及毒理机制，能为人类评价污染物的生态风险提供参考数据。
综上述，本课题拟基于四环素（Tetracyclines, TET）和砷（As），探究不同顺序暴露方式下，两种污染物对斑马鱼的毒性效应。对斑马鱼采取单一暴露，再暴露及暴露后恢复等不同的暴露方式，明确生物体在暴露四环素后恢复过程中的毒性效应以及在肠道微生物菌群受四环素选择压力后对外源污染物砷响应能力的影响。
研究内容与手段：
本研究使用斑马鱼为模式生物，选择TET（50 ppb）和As（100 ppb）作为受试污染物，探究：（1）单一暴露TET和As对斑马鱼的毒性效应；（2）斑马鱼暴露TET后恢复阶段的毒性效应；（3）是否暴露TET对斑马鱼响应重金属As的影响；（4）暴露TET后有无恢复阶段对斑马鱼再暴露As的影响。通过比较斑马鱼个体的体重体长分析表型差异，采用HE染法完成对肝脏和肠道的组织病理学分析，应用qPCR完成肝脏及肠道组织的基因表达分析，应用16S rRNA基因测序完成肠道的微生物菌群分析。
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