开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)
研究问题
本课题拟对前期合成的候选化合物43进行研究,评估其抗肝癌细胞转移的潜力。
研究手段
1、检测化合物43 对肝癌细胞生长活力的影响
通过对肝癌细胞系SMMC-7721培养,使用MTT方法检测化合物43对该细胞系生长活力的影响。MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理是活细胞中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝色结晶物并沉积在细胞中,死细胞无此功能DMSO能溶解细胞中结晶物,用酶标仪在490nm波长处可测定其吸光度值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
2、检测化合物43对肝癌细胞迁移能力的影响
通过划痕实验,检测化合物43对肝癌细胞系SMMC-7721迁移能力的影响。细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法,实验成本低,可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。其原理是,当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白的区域,称为划痕。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使划痕愈合。基本的步骤包括划痕的制造,细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。它的特点是:在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程;非常适合研究细胞与胞外基质(ECM),细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移;与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容,可用于分析细胞间的相互作用;研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。
3、检测化合物43对转移相关蛋白表达的影响
通过western blot 实验,检测化合物对MMP-2、STAT3、pSTAT3蛋白表达水平的影响。western blot,也称western、western blotting、western印迹,它是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。与southern或northern杂交方法类似,但western blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,探针是抗体,显色用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,而且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或者多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
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