开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 实验背景
TNFSF（tumor necrosis factor superfamily，肿瘤坏死因子超家族）成员与他们的受体TNFRSF（TNF receptor superfamily）成员结合，作用于T细胞或B细胞上，通过引起细胞凋亡或作为生长素、生存素调节免疫应答。OX40-OX40L对是其中的一种作用于T细胞的辅助刺激因子，所形成的共刺激信号，能够促进效应 T 细胞的增殖与存活以及记忆T细胞的产生，提供T细胞活化后期的共刺激信号，使激活的初始T细胞增殖和分化成效应T细胞及记忆T细胞[1、14]。研究表明OX40-OX40L组装成功能性三聚体结构的方式与其他不同，连接位点在界面分散不连续，有一定的改造空间[2]。本实验通过Molecular Operating Environment软件对OX40L结构进行优化并与OX40进行对接，力求找出其发挥活性的结构域，优化其结构，为肿瘤免疫多肽的设计提供依据。
研究进展
OX40表达于活化T细胞的表面，提供T细胞增殖和刺激信号，诱导Th2细胞产生细胞因子，促进B细胞分化成浆细胞，促进抗体产生等[3]，属活化后诱导表达，主要为CD4 T细胞、CD8 T细胞表面，同时也表达于APC表面，不仅表达于专职APC表面，如激活的B细胞、成熟的树突状细胞、巨噬细胞等，还表达于非专职APC细胞表面，如朗格汉斯细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞及NK细胞等[12]。初始T细胞活化后短至12h，长至5-6d高表达，记忆T细胞活化1-4h后细胞表面即有高表达。OX40L表达于树突状细胞、B细胞等抗原提呈细胞表面，只有当CD40/CD40L信号结合其他非特异性炎症因子刺激后OX40L才表达，故OX40/OX40L为共刺激因子[4、9]。共刺激因子为微生物的产物或固有免疫针对微生物的应答成分，初始T细胞活化需要2个信号的共同刺激，第一信号来自抗原与TCR的相互作用和结合，第二信号就是共刺激分子的信号，主要是APC表面的共刺激分子与T细胞表面相应的配体相互作用和结合，该信号确保免疫应答的需要的条件下才得以发生[5-6]。
TNFSF成员结构多为由3个果冻卷原体组成的同源三聚体，大多数为II型跨膜蛋白，部分有可使它们从细胞表面释放成为可溶因子的位点[7]。依据其序列以及结构进行分类，分为传统TNFSF（TNF、LTa、LTb、Apo2L/TRAIL、TLIA、LIGHT、FasL、RANKL、CD40L）、EF二硫化组成（APRIL、BAFF、TWEAK、EDA）、新型TNFSF（CD27L、CD30L、GITRL、4-1BBL、OX40L）。传统TNFSF成员三聚体为特征性的锥体结构，CD、DF、DE链由相对长环进行连接，由于DE环上有一个保守疏水性残基（通常为酪氨酸），其在结合受体作用时活跃，常以相似的方法结合受体；EF二硫化组成成员由二硫键连接EF链，三聚体为球形，DE无疏水残基；新型TNFSF成员序列、结构都不尽相同，其中OX40L与其他TNFSF成员序列上仅有10%-15%相似，且仅有132个残基（其他普遍为195个）[2]。
OX40L为Ⅱ型跨膜蛋白，分子量为34kD，缺少TNF同源性，有一个7残基的连接体（其他为50个残基）连接细胞外TNF同源位点与跨膜螺旋。由于OX40L缺少序列保守性，难以产生OX40L三聚体的高质量同源模型。
TNFRSF成员与TNFSF成员不同，通常为细长的分子，通常包括由6个半胱氨酸组成的三个二硫键，被称为CRDs（Cysteine-rich domains），根据半胱氨酸的数目和结合的拓扑结构细分成不同的子单元。典型的CRD由A1和B2子单元衔接而成，其中A1包含1-2二硫键，B2包含3-5二硫键和4-6二硫键。其他变种A2包含2个二硫键，而B1则缺少其中一种二硫键。
不同于OX40L，OX40属于传统的TNFRSF成员，为I型跨膜糖蛋白，分子量为48-50kD，细胞外配基结合单元由3个完整的CRDs和一个C端CRD的一部分组成，CRD1、CRD2组成刚性结构，含有相同的二硫键（A2、B1），CRD3和CRD4的连接可自由回转，因CRD3缺少一个二硫键，缺少的部分也不被氢键或疏水键代替，且由于中间环的缩短和重排，整个模块变小，重排使3-5二硫键呈交叉趋势而非平行趋势，B1连接一个长的含硫环，与CRD4的A1相连。
OX40L由三个同源的砖状的结构单元聚合在一起形成花状三聚体，无传统的金字塔结构，且三聚体界面非常紧凑，只有2600A°2（BAFF：12000A°2）三聚体轴上没有代替芳香残基或疏水残基的“瓷砖”，三聚体界面由非常短的疏水残基C、F链（L102，L138）和特殊结构C端尾组成。3个OX40结合在三聚体轴上生成OX40/OX40L聚合体，结合在单体-单体界面上，结合界面大平且几乎平等分配在左右单体上（左单体包含N166，右单体包含F180）[8]。与传统TNFR不同，OX40由CRD1、CRD2、CRD3参与反应结合OX40L，而传统TNFR仅有CRD2、CRD3参与结合。结合配基的部位不连续，由包括C断尾的11个不同二级结构元件上的31个hOX40L残基连接受体。
有研究在N90D，N114D双糖基化突变的条件下，对OX40L表面氨基酸残基进行丙氨酸扫描突变来确定OX40L表面的哪些部分对受体亲和力有贡献。通过突变，筛选出Q80、E123、T144、D162、N166、F180进行丙氨酸突变后可正确组装成OX40/OX40L聚合物，后使用竞争ELISA中测定评估竞争OX40的IC50，发现N166和F180突变结果几乎检测不到，是因为F180和N166的结合位点在三聚体界面的相对两端，F180与hOX40中CRD1的疏水域通过疏水键结合，N166与hOX40中分别位于CRD2、CRD3的W86和C87的骨架残基生成氢键结合，为重要的结合位点。T144A（F链）和E123A（DE环）则不影响亲和力，Q80A（AA0环）和D162A（GH环）会在一定程度上影响其与受体的亲和力。OX40/OX40L界面不是具有单个“热点”的连续区域，而是分布在至少两个普通区域中的OX40L表面上[11]。单体-单体界面两侧的残基对于高亲和力结合是重要的。OX40复合物的结构可能为寻找其它OX40相互作用提供依据。
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