胸腺肽a1-CH3融合蛋白的表达纯化及活性研究文献综述

 2022-12-26 05:12

开题报告内容：

  1. 研究背景

胸腺肽alpha;1（Talpha;1）是一种由28个氨基酸残基组成的多肽类激素，于1970s被Goldestein首次从小牛的胸腺组织中分离出来。其主要由淋巴组织如胸腺、脾脏等分泌出来，能够促进T细胞的分化和成熟；促进干扰素gamma;、白介素2等细胞因子分泌增加；诱导肿瘤细胞表达抗原，使肿瘤细胞易于被机体的免疫系统识别等等。Talpha;1的免疫调节功能以及对肿瘤细胞的杀伤抑制作用使其受到广泛的关注，并被大量的用于肿瘤治疗的研究中。目前的研究表明Talpha;1和它的改造肽以及与其他药物联合作用对于体内外多种肿瘤的治疗有着明显的疗效：King RS等发现Talpha;1可以治疗败血症和黑色素瘤，且没有发现毒副作用；Arno Sungarian通过研究认为Talpha;1可以通过利用某些细胞因子对肿瘤细胞的杀伤作用来抑制肿瘤细胞的生长。Talpha;1已经被批准用于癌症的治疗，但由于其缺乏肿瘤靶向性使得其在治疗过程中的效果以及在医疗中的应用受到了很大的限制[3]。所以目前在将Talpha;1与其他药物偶联使用来弥补缺陷的方向进行研究，增强其治疗效果。

RGD是一种小分子靶向肽，它与肿瘤血管内皮细胞上高度表达的整合素alpha;nu;beta;3受体有特异选择性和高度亲和力，有效地将治疗药物靶向肿瘤，减少对正常细胞、组织和器官的伤害作用。Sugahara等人对RGD进行了改造，在2010年发现了RGD环肽(iRGD)-肿瘤穿膜肽-可以穿透肿瘤，其与化学药物结合之后可以携带药物深入肿瘤组织之中，达到治疗效果[1]。iRGD与整合素alpha;nu;beta;3受体结合后暴露出Cend R基序能够特异性结合NRP-1来激发肿瘤组织的渗透性，所以经过iRGD修饰的载体系统能够与治疗药物结合之后深入到肿瘤组织内部对肿瘤细胞进行杀伤，形成了一种特殊高效的药物渗透治疗方式，大大加强了药物靶向性治疗的效果，降低了对正常细胞的损害[2]。

CH3是抗体分子的功能区之一，主要功能是与Fc受体结合。研究发现CH3结构域具有延长半衰期的作用，可以增强组织的渗透性，加强药物治疗效果[8]。突变CH3（mCH3)是将抗体上的CH3功能区进行突变以达到延长半衰期的效果。实验结果表明mCH3是一种有广阔应用前景的治疗性蛋白质融合伴侣，具有更好的治疗效果。

目前已经有实验证明野生型Talpha;1具有一定的抗肿瘤作用，且Talpha;1已经作为辅助药物用于临床肿瘤的治疗中。Talpha;1-mCH3能够有效延长药物作用的半衰期，偶联iRGD后能够靶向作用于肿瘤细胞，提高药物治疗效果，延长作用时间，降低肿瘤细胞对正常细胞、组织与器官的伤害是研究Talpha;1抗肿瘤作用的重要研究方向。

  1. 实验目的和意义

Talpha;1具有抗肿瘤效果，但由于其缺乏肿瘤靶向性，使其目前在临床用药中只能作为辅助药物来使用。本次实验目的是将Talpha;1与iRGD偶联使用，利用iRGD的靶向性将Talpha;1带入肿瘤内部进行治疗，同时嵌入抗体mCH3来延长药物的半衰期，增长药物的治疗时间。通过实验小鼠的体内抗肿瘤效果研究来验证其是否有效。这个实验有利于扩大Talpha;1的应用前景，增强Talpha;1在抗肿瘤治疗中的效果，为了解Talpha;1的抗肿瘤作用做出一点贡献。

  1. 实验内容

由公司在体外合成Talpha;1-mCH3-iRGD偶联物，在大肠杆菌中进行表达后分离纯化。将药物注入实验小鼠体内来观察Talpha;1-mCH3-iRGD的免疫活性以及半衰期效果，并与Talpha;1进行比较。

  1. Talpha;1-mCH3-iRGD融合蛋白的诱导表达与鉴定[5]
  2. 含有目的基因的大肠杆菌的表达：将已经含有目的基因的大肠杆菌进行培养发酵后用电泳的方法对表达产物进行分析鉴定。
  3. Talpha;1-mCH3-iRGD的分离纯化：用超声波破碎菌体，用镍柱对目的蛋白进行纯化后将目的蛋白脱盐冻干保存。
  4. Talpha;1-mCH3-iRGD的鉴定:SDS-PAGE凝胶电泳检测是否是所需的融合蛋白。
  5. Talpha;1-mCH3-iRGD融合蛋白免疫活性的研究
  6. HC建立免疫抑制模型：购买适龄小鼠，皮下注射HC，使小鼠萎靡不振、体重下降、毛发直立无光泽，则建立免疫损伤模型成功。同时将小鼠分为给药组、阴性对照组以及空白对照组。
  7. ELISA检测IL-2、IFN-gamma;含量
  8. Talpha;1-mCH3-iRGD融合蛋白体内半衰期的研究

ELISA法检测小鼠血浆中Talpha;1的含量：给小鼠静脉注射Talpha;1和Talpha;1-mCH3-iRGD蛋白样品，给药后定时抽取血样，用ELISA检测其中的药物含量，计算药物的半衰期。

  1. 参考文献
  2. iRGD肽可将抗癌药传递到肿瘤组织内[J].广东药学院学报,2010,26(02):158.
  3. T. Teesalu, K.N. Sugahara, V.R. Kotamraju, E. Ruoslahti, C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell, vascular, and tissue penetration, Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2009) 16157e16162
  4. A.L. Goldstein, A.L. Goldsten, From lab to bedside: emerging clinical applications of thymosin alpha(1), Expet Opin. Biol. Ther. 9 (2009) 593e608.
  5. L. Romani, S. Moretti, F. Fallarino, S. Bozza, L. Ruggeri, A. Casagrande, F. Aversa,F. Bistoni, A. Velardi, E. Garaci, Jack of all trades: thymosin alpha 1 and its pleiotropy, Thymosins in Health and Disease I 1269 (2012) 1e6.
  6. 尹凤红,肖清江,周卫东,陈清西.重组人胸腺肽alpha;1在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定[J].厦门大学学报(自然科学版),2016,55(02):192-197.
  7. 张鹏,黄启来,华子春.胸腺肽alpha;1的研究进展[J].东南大学学报(医学版),2013,32(03):344-350.
  8. Zalevsky, J., Chamberlain, A. K., Horton, H. M., Karki, S., Leung, I. W.,Sproule, T. J., Lazar, G. A., Roopenian, D. C., and Desjarlais, J. R. (2010) Enhanced antibody half-life improves in vivo activity. Nat. Biotechnol. 28,157–159
  9. Hinton, P. R., Johlfs, M. G., Xiong, J. M., Hanestad, K., Ong, K. C., Bullock,C., Keller, S., Tang, M. T., Tso, J. Y., Vaacute;squez, M., and Tsurushita, N.(2004) Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J. Biol. Chem. 279, 6213–6216
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  11. R.S. King, C. Tuthill, Evaluation of thymosin alpha 1 in nonclinical models of the immune-suppressing indications kelanoma and sepsis, Expet Opin. Biol.Ther. 15 (Suppl 1) (2015) S41eS49.
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  16. Pica F, Fraschetti M, Matteucci C, et al. High doses of thymosin alpha 1 enhance the anti-tumor efficacy of combination chemo-immunotherapy for murine B16 melanoma. Anticancer Res. 1998;18:3571-3578.

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