1. 研究背景：
1993年，Lee等人【1】在秀丽线虫中发现了miRNA lin-4，十年后Ruvkun和他的同事又发现了let-7，并确定这种miRNA可以调控lin-14基因(这是秀丽线虫体内调控其生长的一种基因)，从此人们开始了探索miRNA的漫长阶段【2】。经过大量研究，人们认识到miRNA在生物体内发挥着很重要的调控作用，包括人体细胞的凋亡，细胞的繁殖，脂质的代谢，线虫的生长和发育，植物中叶子和花的生长等。随着测序技术和计算机技术的不断发展，现在新发现的miRNA呈现一个指数式的增长，到目前为止，已经在160多种的生物体内发现了约18000种的miRNA【3】。
编码miRNA的基因存在于基因间隔区（基本不参与蛋白质编码的序列），它们最初的表现形式称作初级miRNA，是由RNA聚合酶Ⅱ转录的，这些初级miRNA包含上千个核苷酸序列，其中含有一个颈环结构和一个发卡结构，初级miRNA是一个假性的双链结构。RNA酶Ⅲ Drosha和Pasha将初级miRNA剪切为一个长为60至80个核苷酸的中间体-miRNA前体，在此之前miRNA序列就已经加上了帽子结构和多聚腺苷酸的尾巴。转运蛋白5将其从细胞核转运到细胞质中，前体的miRNA被RNA酶ⅢDicer剪切成长度为18-24个核苷酸的双链miRNA。起初，成熟miRNA与其互补的序列互相结合成miRNA：miRNA* 双螺旋结构（miRNA*为miRNA的互补序列）【4】.双螺旋解旋后，其中一条结合到RNA诱导的基因沉默复合物RISC中【5】.该复合物会结合到目标靶mRNA上，通常情况下，复合物中的单链miRNA与靶mRNA的3，端的非翻译区UTR不完全配对，进而干扰基因的翻译过程。
随着研究的深入，人们发现miRNA在体内水平的下调或者上升，会导致很多疾病的发生。例如，miR-224，miR-378，miR-383,这三种miRNA在卵泡发育过程中能够调节芳香酶的表达【6】；骨关节炎的发生与软骨组织联系紧密，经研究发现，miR-140在软骨的生长以及内稳态的调节中发挥作用【7】，心肌细胞中miRNA的表达异常会影响心肌细胞对各种信号的回应进而打乱心肌细胞的稳态平衡【8】，Corsten MF等研究发现，miR-21在神经胶质细胞瘤中的表达较高，若是其表达水平下调，则会促进细胞的凋亡。
虽然miRNA的研究已取得了一定的成果，但是目前关于miRNA的结构，功能以及研究方法等方面仍然存在很多有待完善和改进之处。
2. 实验依据和目的
现在对于miRNA的研究涉及很多方面，但是其检测方法的优化一直是一个焦点问题。目前，常用的方法有Northern印迹【9】，反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR法）检测【10】，荧光原位杂交【11】,分子信标的方法，液相杂交与显色（Liquid hybridization and color development）等。Northern 印迹是一个比较经典的方法，传统的Northern印迹方法比较繁琐，耗时较长，而且使用起来不是很方便，液相的Northern印迹虽然很快，但是需要检测荧光信号的仪器，这个方法操作起来容易受到RNA酶的干扰，所以在一般的实验中这个方法使用受到较大的限制。RT-PCR是一种广泛用于RNA检测方法，目前已经成功用于前体RNA的检测【12】，在这个方法中，一段目标RNA被逆转录成为互补DNA，再以此为模板进行DNA的扩增，通过检测扩增后的DNA，间接检测miRNA。荧光原位杂交是用荧光标记过的核酸探针来与需要检测的miRNA进行杂交，然后通过检测荧光的强度来定量miRNA，这是一种相对较新的用于生物活性物质分析的荧光检测方法【13】，首次报道是在1996年【14】。信标分子是一种设计好的颈环结构的DNA探针，这种探针的两端设计有一种荧光基团和一个相应的荧光淬灭基团，这个探针是自身可以互补的，当没有靶标序列出现的时候，探针自身互补形成一个环，此时使得荧光基团与淬灭基团靠近，荧光基团被淬灭，当靶标序列和探针互补时，荧光基团和淬灭基团分开，所以淬灭基团不能发挥作用，就会有荧光的产生，通过荧光强度的检测可以测定miRNA。这种方法选择性很好，但是信号放大倍数小，灵敏度不高。现在也有很多研究在原有方法的基础上针对不足之处进行了大量的改进，本实验在总结已有方法的基础上，设计了一种新的用于检测miRNA的手段，以期能有更好的检测灵敏度，进而为miRNA的研究提供一个新的选择。
3. 实验内容：
本实验将采用一种含有全新的荧光基团和淬灭基团的新型Taqman探针，借助Vent(exo-)DNA聚合酶设计一种快速和灵敏的PCR检测方法，根据荧光的有无和强弱定性和定量检测生物样本中的miRNA的含量。
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
