开题报告
一.课题背景
心脏是由心肌纤维组织和瓣膜结构共同组成的空腔器官。它给血液的流动提供动力，帮助其循环到全身各处，为各器官组织提供氧和营养物质，维持机体的正常生命活动。
心肌细胞的结构比较特殊，在其细胞膜靠近肌小节的Z线处向下凹陷形成横管（T-tubule）,并且与肌浆网（sarcoplasmic reticulum,SR）的末端形成耦联结构，当动作电位使心肌细胞去极化时，横管上电压敏感性L-型钙离子通道（L-type Calcium Channels，LCCs）开放，少量钙离子向胞内流入，激活肌浆网上的Ryanodine受体（Ryanodine receptors，RyRs），导致肌浆内大量钙离子释放到胞质中。心肌细胞通过这种钙致钙释放过程（Ca2 -induced Ca2 release，CICR）使得胞质中钙离子浓度迅速增高，并且与细肌丝上的肌钙蛋白C(troponin C)相互作用，导致粗细肌丝相对滑行，最终肌细胞收缩1。随后，胞质中钙离子主要被肌质网钙泵（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2 -ATPase, SERCA）回收、细胞膜上的钠钙交换体(Na /Ca2 exchanger)2等转运出胞质，引起细胞舒张。这种胞浆中钙离子的精确调控确保了心脏的泵血，使得心脏可以有效的行使功能。
在应激情况下，交感神经系统节后神经末梢释放儿茶酚胺类物质，肾上腺素和去甲肾上腺素，激活心肌细胞肌膜上beta;-肾上腺素受体（beta;-adrenergic receptor，beta;AR），引起心率加快，心收缩力增强。beta;AR属于G蛋白耦联受体（G Protein-Coupled Receptor,GPCR）家族，在心肌细胞内有三种亚型（beta;1AR、beta;2AR、beta;3AR），其中beta;1AR占总量的75%，对心肌细胞的收缩有正性变力效应3,4，beta;2AR也与beta;1AR有相似效果，但是效应较低。beta;1AR在心肌细胞中分布广泛，当其被激活时，beta;1AR上的GTP结合蛋白随之激活，GTP结合蛋白的alpha;亚基与beta;gamma;亚基分离，腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase，AC）被GTP结合蛋白活化，促使ATP转变为cAMP（cyclic adenosine monophosphate），cAMP与蛋白激酶 A(protein kinases A)的调节亚基相互结合，被分离的催化亚基发挥作用，将肌膜上的LCCs和肌浆网上的RyR2、受磷蛋白（phospholamban，PLB）等蛋白磷酸化，提高LCCs电流和钙瞬变幅度，加强收缩；解除PLB对SERCA的抑制作用，促进SERCA的钙回收，精确调控胞质中钙离子浓度。
beta;1AR和beta;2AR在正常心肌细胞中的含量比接近80:205，相较于beta;1AR介导的cAMP全细胞效应，beta;2AR产生的cAMP信号具有局域化特性。这主要是由于beta;2AR富集于胞膜窖（caveolae）中6。胞膜窖是细胞膜向内凹陷形成的泡状结构，直径50-80nM，其结构为b2AR介导cAMP局域化提供独立的空间7,8。当beta;2AR与激动剂结合时，PKA磷酸化GRK2，招募大量GRK2聚集到细胞膜，beta;2AR被磷酸化，导致抑制蛋白beta;-arrestin与beta;2AR作用更加紧密，并且募集磷酸二酯酶-4（phosphodiesterase ，PDE4）9,10，促进cAMP的降解11。同时，beta;2AR激活后，GS信号转换为Gi信号12,13，抑制cAMP的合成。降解和抑制双重作用，使得cAMP不能扩散到更远的区域，只产生局域化效应。
beta;3AR在心肌细胞上的表达量较少，其主要通过一氧化氮合酶途径实现对心脏的负性变力效应。beta;3AR可诱导产生cGMP，激活PDE2，水解beta;1AR和beta;2AR介导产生的cAMP，引起心脏收缩速率降低。但由于beta;1AR和beta;2AR在心脏中的表达量远大于beta;3AR，因此beta;1AR和beta;2AR介导的较强正性变力作用将beta;3AR的负性变力作用所覆盖。研究发现，敲除beta;1AR和beta;2AR后，激动beta;3AR，发现细胞收缩功能减弱14。
b2AR激活通过Gs-cAMP-PKA通路只影响细胞膜上的LCCs15，但是对肌浆网上的RyR2作用甚小。有研究发现在心衰模型中，beta;1AR和beta;2AR的含量比接近50:501618，因此beta;1AR介导的正性变力作用也降低。beta;AR持续性激活时，心衰病人细胞内的Gi表达量显著增加，AC的mRNA和蛋白表达水平降低1921，持续性激活beta;2AR，可使其耦联Gi蛋白并表现出对beta;1AR正性变力效应的抑制22，同时，本实验室研究发现，beta;2AR通过招募GRK2磷酸化beta;1AR碳末端，增强beta;-arrestin1与beta;1AR碳末端结合力，并且募集PDE4，从而降解cAMP，将beta;1AR信号局域在2-4nm的膜下微区23。beta;1AR的负反馈调节主要通过PKA和GRK对它的磷酸化修饰，使得Gs蛋白的结合力降低，从而抑制cAMP下游信号，这一过程叫做脱敏（desensitization）。内化是激动剂诱导脱敏的机制之一24，beta;-arrestin1蛋白在内化过程中发挥着重要作用，因此与beta;-arrestin1结合力较高的beta;2AR在激动时，会通过GRK和PKA途径发生迅速脱敏内化25,26，而beta;1AR因为和beta;-arrestin蛋白的结合力稍弱而不容易脱敏内化。
目前本实验室已研究发现b2AR通过激活GRK2，磷酸化beta;1AR碳末端，使beta;1AR获得了通过beta;-arrestin1募集PDE4的能力。PDE4通过降解cAMP产生对beta;1AR信号通路的抑制作用，产生beta;1AR脱敏效应。之前的研究中已经发现，在beta;1AR碳末端的SSES丝氨酸簇突变成不可磷酸化的AAEA时，beta;1AR脱敏效应解除。这说明beta;1AR碳末端在脱敏过程中起到了重要作用。内化作为脱敏的重要机制之一，也极有可能与beta;1AR碳末端丝氨酸簇磷酸化有联系。同时，有研究报道，beta;1AR主要通过PKA和GRK介导的磷酸化过程发生内化，并且在低浓度激动剂作用时，内化主要由GRK信号通路介导，在高浓度激动剂作用时，两种机制同时发挥作用27。但是GRK介导的内化过程中具体的beta;1AR碳末端磷酸化位点尚不清楚。阐明beta;1AR碳末端SSES丝氨酸簇在beta;1AR内化过程中所起的作用，有利于进一步挖掘beta;1AR内化的机制，帮助心脏病找到治疗新靶点，发现疾病治疗的新方向。
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