幽门螺旋杆菌疫苗CUE-GEM在预防性小鼠模型中的细胞及体液免疫研究
选题依据及研究意义
幽门螺旋杆菌是慢性胃炎和消化性胃溃疡等疾病的重要致病因子，与胃癌发生密切相关[1]。研制Hp 疫苗是控制Hp 感染性疾病的一种切实有效的方法。随着现代生物技术的迅速发展，Hp 疫苗的研究也由传统疫苗（多为菌体或其裂解物）向抗原纯度高，特异性强，安全性好的DNA 疫苗和重组蛋白多肽类疫苗等新型疫苗发展[2]，但分子小，免疫原性相对较差，难以产生有效的免疫应答，需要佐剂以增强其免疫原性和宿主对抗原的保护性应答；同时Hp 定植的特殊部位决定抗Hp 感染主要依靠黏膜免疫应答，这对Hp 疫苗佐剂提出了更高的要求[3]。近年来科研人员对Hp 疫苗的佐剂或抗原输送系统进行了大量研究，并取得了较大的进展。第三军医大学邹全明教授课题组研制的口服重组Hp 分子内佐剂疫苗已完成Ⅲ期临床试验，获得国家一类新药证书，目前，还有多个Hp 疫苗处于临床研究阶段。疫苗佐剂，尤其是能够刺激机体产生黏膜免疫反应、增强口服性Hp 疫苗的治疗效果的生物佐剂，是目前Hp 疫苗研发的一个重要方向。
表位疫苗基于抗原表位而制备，具有独特的疫苗设计思路，是研制预防和治疗感染性疾病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病等疫苗的新方向[4]。表位疫苗与全菌疫苗、基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗相比，具有以下优点：（1）表位疫苗一般稳定、无毒，具有更高的安全性。（2）抗原表位肽的分子结构小而简单，不会引起免疫抑制或者自身免疫性疾病。（3）表位疫苗可对抗原表位进行精确定位，具有更高的免疫针对性和特异性。（4）表位疫苗具有十分灵活的设计性，可组合不同Th、B细胞抗原表位，制成针对多种病原体的疫苗。（5）表位疫苗选用高保守性的抗原表位肽，可有效防止病原体快速基因突变所形成的免疫逃避机制。2007年，吴梧桐教授等[5]构建了一个针对尿素酶B亚基的Hp单表位疫苗CtUBE，可诱发特异性抗体免疫应答，有效抑制Hp在小鼠胃部的定植，具有一定的免疫治疗效果。2009年邹全明教授等[6]构建一个针对尿素酶B亚基的Hp多表位疫苗HUepi-LTB，能够诱发细胞免疫应答和特异性抗体体液免疫，有效抑制Hp在小鼠胃部的定植，具有一定的免疫治疗效果。2012年奚涛教授等[7]构建的Hp表位疫苗CTB-UA能够激发BALB/c产生针对Hp尿素酶A、B双亚基的表位特异性抗体，可有效抑制Hp在小鼠胃部的定植，具有一定免疫预防和治疗Hp感染的效果。在Hp疫苗研究领域，表位疫苗与其他疫苗相比，具有很大优势，既可激发更高特异性的抗Hp抗体，又可防止疫苗免疫引起的一些自身免疫性疾病，具有更高的免疫针对性和安全性。
免疫佐剂又称非特异性免疫增生剂，可诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时又能减少免疫物质的用量，降低疫苗的生成成本[4]。佐剂主要的生物学作用包括：（1）增强抗原的免疫原性；（2）增强机体对抗原刺激的反应性；（3）改变抗体类型；（4）引起或增强迟发型超敏反应[13]。一般认为，根据作用机制的不同，疫苗中常用的佐剂可分为两类：第一类是免疫刺激剂，直接作用于免疫系统，激活免疫系统，从而增强和扩大对抗原免疫应答的效应，如toll-like receptor(TLR)配体、鞭毛蛋白、细胞因子等；第二类是作为有效的抗原输送系统，保护抗原免受降解，形成抗原储存库，有利于抗原缓慢释放和高效被免疫细胞摄取，从而提高抗原特异性免疫，如壳聚糖及其衍生物、减毒肠炎沙门菌等。目前，全球常用于临床或临床前研究的黏膜佐剂主要集中在以下几种类型：铝佐剂类、肠毒素类、壳聚糖及其衍生物、Toll-like receptor(TLR)配体类等。铝佐剂是目前唯一通过美国FDA 批准能用于人的佐剂，但只能激发体液免疫，不能诱导T 细胞介导的细胞免疫反应[14]，而最新研究表明在防治Hp 感染的免疫保护性机制中，体液免疫应答和Th1、Th2、Th17型细胞免疫应答都发挥着重要的作用[15-16]。
本课题组在对口服疫苗CTB-UE的机制研究中发现，Hp多表位疫苗CTB-UE免疫的小鼠能激发机体产生IL-4、IFN-gamma;和IL-17细胞因子。对Hp感染C57/BL6小鼠模型和GES-1细胞模型的研究中也发现了Hp多表位疫苗CTB-UE能通过上调microRNA-155来抑制IL-17的表达。对于HP感染的报道[8-12]发现，IL17在Hp诱导的胃部炎症反应中发挥着重要的作用，决定着Hp感染相关性疾病的发展状况。根据国外研究报道[15]，GEM粒子可以通过APCs以配体受体识别方式激活TLR2，促进IL-6、IL-10和TNF-alpha;等促炎细胞因子的合成，具有很好的免疫佐剂功效。基于上述分析，课题组选用了基于乳酸乳球菌所形成的非活性食品级外壳颗粒为载体的一种黏膜给药的系统，即革兰氏阳性增强基质系统（Gram-positive enhancer matrix,GEM）设计出了一种乳球菌为载体的疫苗GEM-CTBUE，此疫苗选取(Gly4Ser)作为linker，并将乳球菌AcmA基因C端3个LysM序列（PA）偶联与CTB-UE的C端，通过基因克隆技术，成功构建了pET28a-CTBUE-PA表达质粒，获得了融合蛋白CTBUE-PA，将其与GEM粒子结合得到乳球菌载体疫苗GEM-CTBUE。GEM粒子能否增强多表位疫苗CTB-UE的免疫原性并起到防治Hp 感染的治疗效果仍需要确证；乳球菌载体疫苗GEM-CTBUE在模型动物体内能否刺激机体产生特异性的体液和细胞免疫并激活相关黏膜免疫反应仍有待实验验证。
本课题组构建的乳球菌载体疫苗GEM-CTBUE，既增强了抗原CTB-UE的免疫原性，又提高了肠道免疫细胞对抗原的摄取能力，并且解决了口服重组乳酸菌抗原表达量低和生物安全性等问题。GEM粒子能激活TLR2，理论上能够激发机体针对多种Hp 病原体蛋白的特异性体液免疫应答和有效的Th1型细胞免疫应答，并通过调节黏膜免疫反应，将发挥良好的免疫佐剂功效。综上所述，本项目通过ELISA 方法检测与Th1、Th2及Th17型细胞免疫相关的细胞因子IFN-gamma;、IL-4、IL-17的表达，揭示出GEM粒子在乳球菌载体疫苗GEM-CTBUE中防治Hp 感染的免疫学机制。本项目的开展，能够为Hp 疫苗的选择提供新的思路，为相关疫苗的研发提供实验基础和理论依据。
研究内容、方案及方法
1 动物分组和给药
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