开题报告
选题依据及研究意义
幽门螺旋杆菌是慢性胃炎和消化性胃溃疡等疾病的重要致病因子，与胃癌发生密切相关[1]。研制Hp 疫苗是控制Hp 感染性疾病的一种切实有效的方法。随着现代生物技术的迅速发展，Hp 疫苗的研究也由传统疫苗（多为菌体或其裂解物）向抗原纯度高，特异性强，安全性好的DNA 疫苗和重组蛋白多肽类疫苗等新型疫苗发展[2]，但分子小，免疫原性相对较差，难以产生有效的免疫应答，需要佐剂以增强其免疫原性和宿主对抗原的保护性应答；同时Hp 定植的特殊部位决定抗Hp 感染主要依靠黏膜免疫应答，这对Hp 疫苗佐剂提出了更高的要求[3]。近年来科研人员对Hp 疫苗的佐剂或抗原输送系统进行了大量研究，并取得了较大的进展。第三军医大学邹全明教授课题组研制的口服重组Hp 分子内佐剂疫苗已完成Ⅲ期临床试验，获得国家一类新药证书，目前，还有多个Hp 疫苗处于临床研究阶段。疫苗佐剂，尤其是能够刺激机体产生黏膜免疫反应、增强口服性Hp 疫苗的治疗效果的生物佐剂，是目前Hp 疫苗研发的一个重要方向。
黏膜免疫通常采用颗粒性载体或可复制菌株作为呈递异种抗原的载体。L. Lactis作为一种公认的安全的微生物，是理想的呈递治疗性蛋白和抗原的载体。L. Lactis的粒径1-10um,刚好是肠道M细胞识别的最佳范围，经口服免疫后，会被肠道派尔淋巴结中的M细胞高效识别并转移穿过上皮细胞，呈递给位于皮下的抗原呈递细胞（APCs，主要是树突细胞）。L. Lactis传递的抗原会被APCs识别然后呈递给特异性免疫细胞引起相应的免疫应答。[13]此外，L. Lactis本身也能引起较弱的免疫应答，外源抗原引起的免疫应答将在整个免疫过程中占优势。机体对外来抗原物质的识别是由特定的受体介导的。目前已证实，这一识别主要是通过细胞表面的Toll 样受体（Toll-like receptor,TLRs）家族分子来实现的。TLRs 可识别病原微生物高度保守的结构基序，即所谓的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，并诱导产生天然免疫应答。特定的TLRs 可以识别相应的PAMPs，其中乳酸乳球菌表面的肽聚糖能以配体受体识别的方式激活表达TLR2 受体的APC，如树突状细胞（DC），巨噬细胞以及肠上皮细胞，诱导分泌前炎性因子及细胞因子，进而介导激活T 细胞和B 细胞应答，但现有研究主要针对Th1型细胞免疫反应，缺少对Th17细胞免疫应答的研究。[14-15]目前，乳酸乳球菌已作为一种有效的佐剂和表达载体运用于各类疫苗的研究中，如人类乳头瘤病毒（HPV）E7抗原[14]、鼠疫(耶尔森氏)杆菌（Yersinia Pestis）[16]、疟原虫（Plasmodium falciparum）[17]、A型流感病毒（Influenza A viruses)[18]等。
本课题组在对口服疫苗CTB-UE的机制研究中发现，Hp多表位疫苗CTB-UE免疫的小鼠能激发机体产生IL-4、IFN-gamma;和IL-17细胞因子。对Hp感染C57/BL6小鼠模型和GES-1细胞模型的研究中也发现了Hp多表位疫苗CTB-UE能通过上调microRNA-155来抑制IL-17的表达。对于HP感染的报道[19-22]发现，IL17在Hp诱导的胃部炎症反应中发挥着重要的作用，决定着Hp感染相关性疾病的发展状况。根据国外研究报道[15]，GEM粒子可以通过APCs以配体受体识别方式激活TLR2，促进IL-6、IL-10和TNF-alpha;等促炎细胞因子的合成，具有很好的免疫佐剂功效。基于上述分析，课题组选用了基于乳酸乳球菌所形成的非活性食品级外壳颗粒为载体的一种黏膜给药的系统，即革兰氏阳性增强基质系统（Gram-positive enhancer matrix,GEM）设计出了一种乳球菌为载体的疫苗GEM-CTBUE，此疫苗选取(Gly4Ser)作为linker，并将乳球菌AcmA基因C端3个LysM序列（PA）偶联与CTB-UE的C端，通过基因克隆技术，成功构建了pET28a-CTBUE-PA表达质粒，获得了融合蛋白CTBUE-PA，将其与GEM粒子结合得到乳球菌载体疫苗GEM-CTBUE。GEM粒子能否增强多表位疫苗CTB-UE的免疫原性并起到防治Hp 感染的治疗效果仍需要确证；乳球菌载体疫苗GEM-CTBUE在模型动物体内能否刺激机体产生特异性的体液和细胞免疫并激活相关黏膜免疫反应仍有待实验验证。
本课题组构建的乳球菌载体疫苗GEM-CTBUE，既增强了抗原CTB-UE的免疫原性，又提高了肠道免疫细胞对抗原的摄取能力，并且解决了口服重组乳酸菌抗原表达量低和生物安全性等问题。GEM粒子能激活TLR2，理论上能够激发机体针对多种Hp 病原体蛋白的特异性体液免疫应答和有效的Th1型细胞免疫应答，并通过调节黏膜免疫反应，将发挥良好的免疫佐剂功效。综上所述，本项目拟通过蒙古沙鼠Hp 感染模型，从体内水平考察GEM粒子在HP疫苗种的免疫原性、免疫特异性及治疗Hp 感染效果，评价其佐剂效应；通过ELISA 方法检测与Th1、Th2及Th17型细胞免疫相关的细胞因子IFN-gamma;、IL-4、IL-17的表达，揭示出GEM粒子在乳球菌载体疫苗GEM-CTBUE中防治Hp 感染的免疫学机制。本项目的开展，能够为Hp 疫苗的选择提供新的思路，为相关疫苗的研发提供实验基础和理论依据。
研究内容、方案及方法
A、Hp疫苗GEM-CTBUE 的分子生物学构建、原核表达及纯化
通过GenBank 数据库对乳酸乳球菌（GenBank：NC_017949.1）细胞壁水解酶蛋白AcmA 基因序列进行分析，查找序列C端保守结构确定3个连续LysM保守序列位置 ，PCR获得锚定蛋白PA的基因序列。利用PCR 技术以乳酸乳球菌NZ9000基因组（含有AcmA基因）为模板扩增目的基因PA，然后通过双酶切技术将扩增出来的目的基因PA插入到pET28a-CTB-UE重组表达载体中，后将重组表达载体pET28a-CTB-UE-PA 转化进BL21(DE3)大肠杆菌中。利用IPTG 诱导表达重组基因工程菌株BL21(DE3)/pET28a-CTB-UE-PA，从温度、IPTG 浓度、诱导时间等多个因素，对重组基因工程菌株的表达条件进行优化，以便获得大量目的蛋白；利用Ni-NTA 镍离子亲和层析和DEAE Sepharose FF 阴离子交换层析等多种蛋白纯化技术，获得高纯度的CTBUE-PA融合蛋白。
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