开题报告内容：
1.研究意义
1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1DM),是一种器官特异性自身免疫性疾病，临床表现为机体对胰腺抗原成分免疫欠耐受,针对胰腺beta;细胞发生自身免疫性破坏[1],进而导致胰腺功能丧失,胰岛素分泌减少或缺乏,出现高血糖等代谢紊乱。1型糖尿病具有家族遗传性，常在35岁以前发病，目前还没有根治该疾病的方法，一旦发病,患者需要终身使用外源性胰岛素来控制血糖，因此1型糖尿病也曾经被称为胰岛素依赖性糖尿病，所以针对其开发预防和治疗性疫苗均具有临床意义。
作为自身免疫性疾病的一种，1型糖尿病的发病机制复杂，并发症多样，长期高血糖还会诱发糖尿病肾病、眼病、足病、脑病等一系列的糖尿病并发症。与1型糖尿病有关的因素有（1）自身免疫系统缺陷（2）遗传因素（3）病毒感染。目前人们已经发现在临床高血糖症状之前，自身免疫抗原如胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛素瘤抗原(IA-2)、胰岛特异性6磷酸葡萄糖催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛锌离子转运蛋白(ZnT8)以及嗜铬粒蛋白A等可在数月或数年之前就检测到[2]。
1型糖尿病预防和治疗的重要手段之一是使用自身抗原免疫机体诱导耐受的重新建立，谷氨酸脱羧酶65(glutamic acid decarboxy lase,GAD65)是一种重要的beta;细胞特异性的1型糖尿病自身抗原，是NOD小鼠由外周胰腺炎发展为内部浸润的关键靶点。研究者使用基因方法发现，使beta;胰岛细胞的GAD65表达缺失可保护细胞免受T细胞介导的免疫攻击，防止NOD小鼠发生l型糖尿病，即NOD小鼠的beta;细胞表达 GAD65分子是发生1型糖尿病的必要条件。另据报道GAD65与巨细胞病毒蛋白具有分子相似性，当病毒感染后，因病毒与beta;细胞具有相同抗原性而导致机体免疫系统产生交叉免疫反应，针对病毒的抗体及效应T细胞在消灭病毒的同时也破坏了beta;细胞。此外，在1型糖尿病病人以及模型动物血清中可以检测到针对GAD65抗体的存在,并且存在针对GAD65及其相关肽的T细胞自免疫攻击也是1型糖尿病的显著特征。
霍乱毒素B亚单位(CTB)是一种重要的疫苗载体,它是霍乱毒素的无毒亚单位,是一种五聚体蛋白，具有结合真核细胞神经节苷脂GM1受体的功能,可以使得与它结合的抗原分子紧密结合在粘膜细胞表面,是很好的粘膜免疫剂,使用其作为载体能达到无创给药的目的[3] 。同时使用CTB作为在位佐剂,可以有效降低抗原给予量以及免疫次数,防止致命性过敏反应的发生。
已有将CTB与胰岛素分子经化学结合后口服给予NOD小鼠的报道，其所需的胰岛素剂量是单纯口服胰岛素的1/5000~1/500,且胰岛炎症程度较轻,保护时间也显著延长。但是化学交联结合的蛋白成分混杂，而单一蛋白分子成分单一且操作简单。Arakama等将胰岛素B链与CTB融合表达后,口服给予NOD小鼠有效地诱导了免疫耐受[4,5]。Jide等将GAD分子的 509~528和524~543区域小肽通过滴鼻方式给予NOD小鼠，成功地诱导了免疫耐受，阻止了1型糖尿病的发生[6]。Ogino等证实，被T淋巴细胞首先识别的核心氨基酸序列位于533~541处,GAD分子531~545这段氨基酸序列也能够激活T淋巴细胞使其增殖，注射NOD小鼠后能够诱导免疫耐受，且这段序列在人和小鼠中完全相同[7]。
本实验通过将单独免疫具有预防作用的GAD65肽段利用分子融合手段,依次连接到CTB分子的C端后,表达纯化该蛋白并复性,为糖尿病的发病、治疗、预防等研究奠定基础。
2.拟研究的问题
大肠杆菌中CTB-GADⅢ蛋白的诱导表达、纯化及复性研究
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