开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
研究背景： 1 型糖尿病( type 1 diabetes mellitus，T1DM)，常见于儿童和青少年，通常是由遗传、免疫紊乱或微生物感染等因素共同作用导致的慢性自身免疫性疾病[1]。由于机体异常导致胰岛beta;细胞受到T淋巴细胞介导的自身免疫性破坏，从而使其丧失合成和分泌胰岛素的功能，引起糖代谢紊乱的一类疾病[2、3]。患者主要症状是三多一少，即多饮、多食、多尿、体重减轻。患者在发病前期存在胰岛炎，当症状显现时，80%的胰岛beta;细胞已经被破坏[4]。截止到目前为止还没有根治该疾病的方法，故一旦发病，患者需终生注射胰岛素进行控制，给患者带来极大的不便和痛苦。虽然T1DM也由遗传和环境因素等大量未知因素影响，但自身免疫反应异常却被认为是T1DM出现和发展的主要原因[5]。因此，利用自身抗原特异性免疫调节来预防或干预1型糖尿病的方法有较好的效果且针对性强，所以近年来得到广泛的关注。
2004年，Brinkmann等定义了中性粒细胞受到刺激并死亡之后其细胞外基质中出现一种蛋白质镶嵌染色质网络结构[6]，这种炎性期激活的中性粒细胞可以形成胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs），而中性粒细胞胞外诱捕网的形成过程称为NETosis，这是一种不同于细胞坏死和凋亡的特殊的细胞死亡途径[7]。NETs能够初步、非特异性作用于感染的早期阶段入侵的病原体，可以有效捕获并毁灭大型生物结构，比如真菌以及原生动物[8]。NETs能被多种无机或者有机因素诱导形成，不同的诱导因素能够诱导NETs形成不同的附着蛋白[9]，并引起不同的细胞内变化[10]。NETs结构简单，是中性粒细胞在感染部位主动释放大分子DNA作为网状支架，对病原菌进行包围及限制，通过附着于DNA支架上的组蛋白和颗粒蛋白杀灭病原菌的结构。NETs由染色质与多种来自于细胞内的蛋白构成[9]，在胞外诱捕网产生期间，细胞内的组氨酸，抗原等释放到细胞外基质中，被呈递给免疫活性细胞从而促进自身抗体的合成。如果机体局部出现高浓度的NETs，会导致组织损伤、器官机体失调或衰竭[11]。因此表明，胞外诱捕网的形成在自身免疫疾病的发生中发挥关键作用[12]。已经有研究证明NETs的形成与很多自身免疫疾病相关，比如小血管炎[13]，系统性红斑狼疮[14]，类风湿性关节炎[9]等。而且还有研究表明，NETs与T1D的发病以及T1D伤口愈合等密切相关。
DNase是核酸内切酶，能催化单链DNA和双链DNA降解，产生具有5-磷酸末端的分解物。研究表明DNase一方面能够通过降解NETs从而抑制其抗菌作用的发挥，另一方面也能从而保护组织免受自身免疫攻击。如果NETs大量形成，并且缺乏DNase进行降解，就会造成NETs的持续性存在，从而导致组织损伤或者自身免疫疾病的发生。NETs含有DNA骨架，因此能被DNase催化降解。Brinkmann等证实DNase体外处理活化的中性粒细胞，而中性粒细胞丧失依赖NET杀灭微生物的作用，且发现DNase以浓度依赖性方式催化NET降解,由此说明DNase对中性粒细胞形成NET有潜在的调节作用[15]。
另外我们选择乳酸乳球菌的pCYT质粒作为DNase I的递呈载体。乳酸乳球菌是一种革兰氏阳性乳酸菌，是一种安全的食品级微生物，目前广泛用于外源蛋白的高效表达和疫苗的递呈，其具有众多优点，比如具有较高的安全性，从而被现代食品工业和生物技术领域广泛研究和使用[16]；其遗传特点已经研究得比较清楚，对外源目的蛋白的兼容性好；其自身产生的蛋白量很少，对外源蛋白的表达干扰较小；能够顺利通过胃肠道而有效抵御胃酸的侵蚀，保证较高的存活率[17、18]。本课题的主要流程是通过将人源的DNase I 基因序列进行密码子优化后，人工合成了可在乳酸乳球菌中有较高表达效率的DNase I基因片段，并将其连接入pCYT 载体中，构建重组质粒，再将重组质粒通过电转化的方式导入乳酸乳球菌中，通过NICE系统成功诱导其进行内源性表达，并在体外验证其具有降解核酸的酶活性。
研究的问题：1.重组PCYT：DNase I的构建、转化以及结果验证。
2.乳酸乳球菌中pCYT：DNase I的诱导表达。
实验方法：
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