一、课题的目的
HERG基因能在HEK293细胞稳定中表达。它是利用Lipofectamine2000将pCDNA3.0-HERG转染进入HEK293细胞,通过G418筛选阳性克隆细胞系,采用免疫荧光细胞化学方法检测该蛋白的表达,用全细胞膜片钳技术测定HERG基因介导的快速激活延迟整流钾电流(Ikr)。结果免疫荧光细胞化学检测证实转染HEK293细胞中HERG通道蛋白的表达,膜片钳全细胞实验记录到Ikr。结论该方法有效地将HERG基因转染进入HEK293细胞,并稳定表达HERG通道蛋白及介导Ikr。
现代化工业生产中人工合成基因的方法很多，但往往过程复杂，成本较高。因此本文探索了一种重复性好、错误率低、低成本和简便的基因设计和全合成方法。
二、研究方案
主要利用PCR技术进行基因的扩增； PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的半保留复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
首先我们需要对这段基因进行分析，这段基因中的主要酶切位点，GC的分布情况，以及这段基因的重复情况，这些都是设计订单时的注意点。待这些情况都能解决之后，我们才考虑到引物的分段。
通过引物的扩增将一段段引物拼接到一起，扩成一段很长的目的基因。第二轮反应则可以在这段基因的首尾加上保护碱基和酶切位点，之后做连接转化，通过酶切把这段基因切成粘性末端与用同一种酶切过的载体在连接酶的作用下组合在一起，随后转入大肠杆菌中，大肠杆菌的复制带来了这段基因的复制。菌检可以通过蓝白斑筛选和抗生素筛选，结合菌落PCR扩增技术筛选出含有目的片段的阳性克隆送测序部测序，以此来降低生产成本。
三、研究途径
2.1引物的设计与分段
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