- 课题背景
p53是一种重要的抑癌基因，与肿瘤的形成有着密切联系。研究表明，p53基因功能广泛，可促使细胞凋亡、阻滞细胞周期以及参与DNA损伤修复等[1]。在正常情况下，p53基因对细胞分裂起控制监视作用。当体内DNA发生变异时，p53基因判断DNA变异的程度，若变异较小，p53促进细胞的修复，若变异较大，则诱导细胞凋亡化[2]。p53的失活是致癌作用的主要驱动力，在所有的恶性肿瘤中，该基因突变的频率达50%以上，表明其在肿瘤抑制中的关键作用。此外，p53基因突变还能增加机体对抗癌疗法的抵抗，因此p53基因是癌症治疗中的一个至关重要的药物靶点。
p53基因的转录产物可直接或间接的参与其他蛋白的转录从而控制癌症的发生。野生型p53蛋白作为一种位于细胞核的转录因子，其结构包括N末端反式激活结构域、DNA结合结构域、四聚体化结构域和多功能C末端结构域[3-4]。磷酸化和乙酰化过程可调节p53的活性, p53蛋白的第15位和37位丝氨酸磷酸化以及第373和382位的赖氨酸乙酰化都能够显著提高p53蛋白的转录激活能力。活化的p53蛋白可以与特定的DNA序列相结合从而调控基因的表达[5]，完成诱导细胞凋亡、衰老以及控制细胞周期等生物学功能。
近年来，p53在肿瘤研究方面的应用得到明显提升。调查显示，使用基因工程手段介导的p53基因转移并表达于肿瘤细胞中,已经形成了多种临床肿瘤治疗方案, 例如包括头颈部肿瘤、 肺癌、 肝癌、 乳腺癌、 脑瘤等多种肿瘤在内的研究治疗，并且在美国、日本和欧洲等国家和地区得到成功应用, 同时在一些晚期肿瘤的治疗过程中，p53基因还具备其独特优势[6]。
恢复突变型p53的野生型活性是开发以p53为靶点的抗癌药物的主要策略之一。研究表明，来源于p53 C端结构域的合成多肽p46可以恢复突变型p53的肿瘤生长抑制功能[7]。p46 (peptide 46, GSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKK)，即人p53的361-382片段，是一种富含赖氨酸的22肽，相应于p53的单股DNA末端结合位点。在体外，p46能活化野生型p53的DNA结合作用，并且可以恢复活细胞内一些突变型p53蛋白的转录反式激活功能，诱导表达p53的肿瘤细胞发生凋亡[8]。
随着对肿瘤的深入研究，越来越多的抗肿瘤药物被开发应用并且效果显著。但是，由于肿瘤微环境的血管异常、间质压力高等特点，使得治疗药物难以渗透至肿瘤深部发挥抗肿瘤效应。抗肿瘤药物如何跨越血管壁并有效地穿透到肿瘤实质成为肿瘤靶向治疗的主要研究方向[9-10]。RGD肽是一种序列为精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的靶向肽。肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞表面特异性高表达alpha;vbeta;3、alpha;vbeta;5受体，RGD肽段可与肿瘤细胞上的alpha;vbeta;3、alpha;vbeta;5受体结合,从而实现对肿瘤细胞的靶向，提高化疗药物的抗肿瘤效应[11]。
2010年Sugahara KN[12]等报道了新型环肽iRGD（internalizing RGD,CRGDK/RGPD/EC）能够提高抗肿瘤药物在肿瘤组织中的渗透能力, 引起了广泛关注。肿瘤靶向肽iRGD由9个氨基酸残基组成，其结构中包含三个部分：肿瘤血管靶向的RGD序列、CendR基序和蛋白酶识别位点[13]。通过RGD肽与肿瘤细胞表面的整合素受体特异性结合，促进蛋白酶对iRGD的水解切割，从而暴露出内部的CendR基序，CendR基序与肿瘤细胞表面的NRP-1受体特异性结合，介导iRGD的内化。因此iRGD肽可穿透肿瘤组织，靶向运输到特定的肿瘤部位，从而显著提高药物在肿瘤组织的穿透能力, 促进药物在血管外的肿瘤细胞中的分布[14-15]。利用iRGD肽的靶向性和穿透性，将iRGD与药物分子连接，可以实现药物的靶向投递，促进药物在肿瘤组织的积聚，具有广阔的应用前景。
在本课题中，我们将人细胞肿瘤抗原p53的361-382片段（即p46）与肿瘤穿透肽iRGD融合表达，通过基因工程的方法，采用大肠杆菌原核表达系统进行诱导表达，然后分离纯化得到目标融合肽p46-1，研究该新型融合肽的抗肿瘤效果，评估iRGD靶向对多肽抗肿瘤活性的影响，为新型抗肿瘤多肽的研发奠定基础。
- 实验目的和意义
本实验中我们分别构建p46以及p46-1质粒载体，导入大肠埃希氏菌中诱导表达，并分离纯化得到p46以及p46-1，优化诱导表达以及分离纯化的条件，以期得到稳定高效的多肽制备工艺，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。对p53功能及分子机制的深入研究有助于其在肿瘤治疗方面的应用，提供全新的研究视角，为更多的肿瘤患者带来新的希望。
- 实验内容
本课题内容可分为以下三个部分：
1.p46和p46-1在大肠埃希氏菌中的表达
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