现如今，肿瘤的发生率越来越大，相应地，对肿瘤的研究力度也日渐加大，发现Ｒaf 激酶在肿瘤的发生中至关重要。
Ｒaf 激酶家族有3 个亚型: A-Ｒaf、B-Ｒaf 和CＲaf，这3 个亚型均有3 个保守区域( conserved regions，CＲ) : CＲ1、CＲ2 和CＲ3。CＲ1 由Ｒas 结合域( Ｒas-binding domain，ＲBD) 和富含半胱氨酸结构域( cysteine-rich domain，CＲD) 构成。CＲ1 能和Ｒas 蛋白以及细胞膜磷脂相作用。CＲ2是一个富含丝氨酸/苏氨酸结构域( serine /threonine rich domain) ，此区域含有一个能与调节蛋白14-3-3 结合的位点，磷酸化后的该位点与14-3-3 结合产生抑制效应。CＲ1 和CＲ2 区域位于激酶N 端调节区。CＲ3 是催化结构域( protein kinase domain) ，此区域靠近激酶C 端。在3 个保守区域中，CＲ3 是3 个Ｒaf 激酶亚型同源性最高的区域。在C 端也存在1 个与14-3-3 结合的位点。在3 个亚型中突变率最高的是B-Ｒaf。B-Raf 绝大部分突变形式为B-RafV600E，即该酶激活片段600 位的缬氨酸被谷氨酸所取代，这种突变可致酶活性提高约500 倍，可持续激活下游的信号级联效应器MEK 和ERK，导致这条信号通路的持续激活，对肿瘤的发生、生长增殖和侵袭转移至关重要，现已成为抗黑色素瘤等突变肿瘤的有效作用靶标之一。
与大多数蛋白激酶一样，B-Ｒaf 激酶由3 个区域组成: N 端、C 端以及铰链区( the hinge region)。N 端主要由beta; 折叠组成，而C 端主要由alpha;-螺旋组成。由于激酶类抑制剂主要模拟ATP 与激酶的结合模式，所以主要研究的激酶结构区域为与ATP 结合的催化裂口。催化裂口中重要的结构片段为:甘氨酸富集区、gatekeeper 残基( 在铰链区的前段，Thr529) 、N 端的alpha;C-螺旋、活化环和其上的DFG 序列以及由Lys483( in beta;-sheet Ⅲ) 与Glu501 ( in alpha;C-helix ) 形成的盐桥。
随着人们对B-Ｒaf 激酶结构的不断认识，设计并合成了很多结构类型的B-Ｒaf 激酶抑制剂，如三芳基咪唑类、嘌呤类、吡嗪类、苯并咪唑类等。根据与B-Ｒaf 激酶结合模式的不同，将这些抑制剂分为两类: Ⅰ型和Ⅱ型。I 型抑制剂结合激酶的活性构象, 是ATP 竞争性抑制剂，如威罗菲尼、PLX4720、SB-590885、dabrafenib等。此类抑制剂是模仿ATP与激酶的作用模式，因此该类抑制剂结构中大都有杂环占据腺嘌呤区，与激酶铰链区的关键氨基酸残基形成1 ～ 2 根氢键。与杂环相连的其他基团也会占据激酶的其他口袋，比如靠近腺嘌呤区的疏水口袋、核糖区( ribose region) 以及磷酸化区( phosphateregion) ，以此来增强激酶抑制剂的活性和选择性。II 型B-Raf 激酶抑制剂与Raf 激酶非活性构象结合，如索拉菲尼、瑞戈菲尼等。此类抑制剂中激酶的构象为非活性构象，是由DFG 序列位置的改变产生的。DFG 构象发生重排并移动进入到ATP 结合口袋，阻碍了该口袋与ATP 的结合，形成非活性构象，此构象中alpha;C-螺旋的位置并没有发生变化( DFG-out，alpha;C-helix in) 。由于DFG 序列位置的改变，暴露出了1 个与ATP 结合位点直接相邻的疏水结合位点( DFG-out 变构结合位点，allosteric site) ，同时在激酶的后端裂口暴露出来1 个疏水性口袋。索拉菲尼是第1 个报道的ⅡA 型B-Ｒaf 激酶抑制剂。此外，还有一种机制，根据图9，分析PLX4032 与B-ＲafV600E蛋白激酶的晶体复合物，发现: ①7-氮杂吲哚环占据着ATP 结合口袋，其中7 位N 原子作为氢键受体与Cys532 形成氢键，1 位NH 作为氢键供体与Gln530 形成氢键; ②3 位取代的羰基可以与一个水分子形成氢键; ③二氟苯基占据着由Ala481，Val482，Lys483，Val471，Ile527，Thr529，Leu514 以及Phe583 形成的疏水性空腔，两个氟原子的引入可改善药代动力学性质; ④磺酰胺上的N 原子能与Asp594 形成氢键，O 原子与Phe595 和Gly596形成两根氢键，丙基占据着Ｒaf 激酶选择性口袋（Ｒaf-selective pocket，其他激酶很少有这个选择性口袋)。与上述两种结合模式相比，该模式中发现了B-Ｒaf 选择性口袋。该口袋的发现使得该类激酶抑制剂的选择性大大增加。另外，目前研制出来的抑制剂从结构上基本可以分为五大类：（1）脲类；（2）脲类化合物生物电子等排体；（3）双芳基咪唑类；（4）苯甲酰胺类；（5）吲哚酮类等。其中，脲类和其电子等排体类化合物是所有Raf激酶抑制剂中研究最多的类型。Bay-43-9006（Sorafenib）即属脲类，它已于2005年12月作为肾癌的治疗药物首次上市，成为第一个临床应用的Raf激酶抑制剂。时，Sorafenib还是一个广谱抗肿瘤药物，其对黑色素瘤、肝癌、非小细胞肺癌等肿瘤细胞均具有显著作用。Sorafenib具有非常强的体外Raf激酶抑制活性（IC50 = 12nM），而在动物血浆中也达到了较高的浓度水平并成功抑制了多种异种移植肿瘤模型的肿瘤的生长；临床研究中疗效确切，具有良好的安全性，其最常见的副作用仅为腹泻。因此靶向Raf激酶的小分子抑制剂不仅是目前抗肿瘤药物研究中的热点，而且已经取得了一定的突破，是研发新一代抗肿瘤药物中具有确切意义和希望的方向。
随着肿瘤细胞对B-Raf 激酶抑制剂耐药性的出现，近年来，研究人员努力探寻与耐药相关的具体机制，以期能找到新的治疗手段。研究表明，对威罗菲尼、dabrafenib、PLX4720 和SB-590885 等Ⅰ型抑制剂产生耐药的机制主要包括以下2 种途径：一种途径为肿瘤细胞通过COT（由MAP3K8 编码）、NRAS、p61B-RafV600E、MEK 等突变体重新激活ERK 磷酸化，另一种为激活细胞膜表面酪氨酸激酶受体（RTK），建立不依赖于ERK 磷酸化的生存途径。针对索拉菲尼这种Ⅱ型抑制剂的研究表明，肿瘤细胞中存在多种旁路机制，促使其对索拉菲尼产生获得性耐药。主要有磷脂酰肌醇-3- 羟激酶/ 蛋白激酶B 通路、Janus 激酶/ 信号转导和转录激活因子通路、上皮细胞- 间充质转化等，一些研究还表明，EGFR、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、多药耐药蛋白2（MDRP2）、NF-kappa;beta;、自噬及缺氧微环境也可能参与肝癌组织对索拉菲尼产生获得性耐药的过程。随着B-Raf 激酶抑制剂耐药机制不断地被发现和阐明，可以相信，这将会更快更好地促进联合用药、间歇性给药以及个体化治疗等新的治疗策略的发展，同时也为多靶点抗肿瘤药物的开发提供了一定思路。
很多肿瘤依赖于突变B-Raf 来增殖和生存, 因此B-Raf激酶仍旧是肿瘤治疗中的热点研究靶点之一。目前开发的一些特异性抑制B-RafV600E 的抑制剂正处于临床研究,展现出很好的前景。相信今后特异性针对B-Raf 的新型抑制剂将不断被开发出来, 并用于肿瘤临床治疗中。
参考文献
［1］ Howe LＲ，Leevers SJ，Gmez N，et al． Activation of the MAP kinase pathway by the protein kinase raf［J］． Cell，1992，71( 2) :335 － 342.
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