课题背景：
神经胶质瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半，由于其恶性程度高，侵袭能力强等特点严重危害着人们的健康，故研究神经胶质瘤的发病分子机制和临床治疗方案迫在眉睫。
长链非编码RNA (long noncoding RNA, IncRNA)是一种内源性、长度超过
200个核苷酸、不编码蛋白的转录物。随着转录组测序的进步,越来越多的证
据表明长非编码RNA在细胞生物学中参与多重层次的调控功能,包括在表观遗传水平,转录水平,以及转录后水平调控基因的表达。具体作用方式包括:参与组蛋白修饰复合物的组装过程,促进激素信号传导通路的激活,参与mRNA的转录后加工过程如剪接,通过同源区域与mRNA产生直接相互作用而介导mRNA的降解,与miRNA竞争性结合靶mRNA而阻碍miRNA行使功能等。
IncRNA可以影响肿瘤中的抑癌信号通路。如HOX transcript antisense RNA
(HOTAIR)在乳腺癌、肝癌和结肠癌中表达异常,通过将Polycomb抑制复合物2 (Polycomb Repressive Complex 2, PRC2)招募到抑癌基因座位上,抑制抑癌基因的表达,从而促进肿瘤增殖并抑制凋亡。另外,在DNA损伤等应激状态下,P53可以直接诱导taurine upregulated 1 (TUG1)等IncRNA的表达,这些IncRNA通过与蛋白相互作用,调控与细胞周期相关基因的表达。
荧光原位杂交技术问世于70年代后期，其曾多用于染色体异常的研究，近年来随着FISH所应用的探针钟类的不断增多，特别是全Cosmid探针及染色体原位抑制杂交技术的出现，使FISH技术不仅在细胞遗传学方面，而且还广泛应用于肿瘤学研究，如基因诊断基因定位等 。FISH具有①操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年.②方法敏感,能迅速得到结果.③在同一标本上,可同时检测几种不同探针.④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究。通过芯片筛选出目的LncRNA,应用FISH技术定位其在神经胶质瘤细胞中的位置，为后续研究提供指导性的意义。
应用CRISPR/Cas9技术，实现目的LncRNA的基因敲除，建立基因敲除的平台，研究目的LncRNA的相关功能，为后续研究提供指导意义。 CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
本课题着眼于人胶质瘤细胞中的长链非编码RNA。针对LncRNA芯片筛选出的目的LncRNA,运用FISH技术在人神经胶质瘤细胞中进行亚细胞定位，从而为lncRNA可能参与的作用提供线索。同时运用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除，为研究其功能提供基础。
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